Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

We beschrijven het gebruik van een standaard optische microscoop kwantitatieve metingen van gewicht, volume en dichtheid op cellulaire monsters uitgevoerd door een combinatie van helderveld en differentieel interferentie contrast beelden. Twee primaire benaderingen worden gepresenteerd: noninterferometric kwantitatieve fase microscopie (NIQPM), op de metingen van de totale celmassa en subcellulaire distributie dichtheid te voeren, en Hilbert transformeren differentieel interferentie contrast microscopie (HTDIC) om het volume te bepalen. NIQPM is gebaseerd op een vereenvoudigd model van de voortplanting van golven, aangeduid als de paraxiale benadering, met drie onderliggende veronderstellingen: lage numerieke apertuur (NA) verlichting, zwak verstrooiing, en zwakke absorptie van licht door het monster. Gelukkig unstained cellulaire monsters aan deze veronderstellingen en lage NA verlichting is gemakkelijk te bereiken op de commerciële microscopen. HTDIC wordt gebruikt om volumetrische informatie te verkrijgen van door-focus DIC beelden onder hoge NA illuminatie voorwaarden. Hoge NA-verlichting kunnen verbeterde opdeling van het monster langs de optische as. Hilbert transformatie proces op de afbeelding DIC stapels verbetert randdetectie algoritmen voor het lokaliseren van het monster grenzen in drie dimensies door het scheiden van de grijswaarden van het monster intensiteit van die van de achtergrond. De belangrijkste voordelen van NIQPM en HTDIC lag in hun technologische toegankelijkheid met "off-the-shelf" microscopen. Er zijn twee fundamentele beperkingen van deze methoden: slow z-stack overname tijd op commerciële scopes heft momenteel het onderzoek naar verschijnselen sneller dan 1 frame / minuut, en ten tweede, diffractie effecten beperken het nut van NIQPM en HTDIC om objecten van 0,2 tot 10 (NIQPM) en 20 (HTDIC) micrometer in doorsnede, respectievelijk. Daarom moet het model en de bijbehorende tijdsdynamiek plaats aan bepaalde grootte en temporele beperkingen op het gebruik van deze werkwijzen mogelijk. Opwindend, de meeste vaste cellular exemplaren worden gemakkelijk onderzocht met deze methoden.

Introduction

Het gebruik van optische microscopie is nu alomtegenwoordig in het onderzoek naar de cellulaire organismen. Door hun lage endogene absorptie en verstrooiing zwakke eigenschappen over het zichtbare optische spectrum, worden cellen niet sterk beïnvloeden de amplitude van de optische golven te doorkruisen en lijken derhalve semi wanneer afgebeeld met standaard helderveld microscopen. Cellulaire specimens Wel vertragen optische golven reizen door hen op een wijze die recht evenredig is met de hoeveelheid lokale massadichtheid in een bepaald gebied van de ruimte waardoor het licht reist. Benutting van deze heterogene vertraging of "fase" profiel van optische golven die via microscopische preparaten werd voor het eerst beschreven in 1935 door Frits Zernike ¹ en experimenteel gerealiseerd door Zernikein 1942 ^2. Zernike werd bekroond met de Nobelprijs in 1953 voor deze prestatie. Zeiss gecommercialiseerd deze modaliteit in 1945 ^3. In 1955, Smith en NomarskIk zou hun eerste werkzaamheden op het gebruik ⁴ en theorie ⁵ van differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie is een modaliteit die de ruimtelijke gradiënt van fase gebruikt als contrast mechanisme presenteren. DIC werd gecommercialiseerd door Zeiss in 1965in nauwe samenwerking met Nomarski ^6. In 1981, twee laboratoria aangetoond dat de eerste geregistreerde levende cellen DIC beeldspraak met de opname van video-camera's in de optiek trein van de DIC microscoop ^{7, 8.} Het tijdperk van live cell imaging werd geboren.

Sinds die tijd heeft de uitvoering van zowel fase-contrast-en DIC op commerciële microscopen grotendeels ongewijzigd geweest. Deze methoden worden voornamelijk gebruikt door biologen om beelden van cellen te produceren voor de kwalitatieve doelen: monitoring van de morfologie, het volgen van subcellulaire structuren, en onderzoeken van membraan dynamica ^9. Deze technieken zijn kwalitatief van hun "off-the-shelf" configuratie zowel fase en DIC afbeeldingen zijn willekeurig functies van de lichtbron intensiteit, de verlichting optiek instellingen, en CCD-camera te krijgen, gamma, en belichtingsinstellingen.

Een klein legioen van fysici en optische ingenieurs heeft getracht om commerciële beeldvormende modaliteiten kwantitatieve maken. Een van de eerste pogingen waren twee brieven aan de natuur in 1952 en 1953, waarin de arts-draaien-biofysicus Robert Naakter aangetoond dat het gebruik van fase microscopie om cellulaire droge massa van cellen te bepalen door een schatting fase verschuivingen door middel van deze celtypen met een algemeen verkrijgbare fase microscoop ^{10, 11.} Fase microscopie ^10,11, DIC microscopie ^12-17, en helder veld ^18-22 optische weglengte, fase, de massa te bepalen: Het veld heeft een veelheid aan technieken in de daaropvolgende jaren gebaseerd op drie basis-label-free contrast mechanismen ontwikkeld dichtheid, brekingsindex en celvolume.

In parallel, een grote collectie aangepaste optische instrumenten zijn ook ontwikkeld sinds de jaren 1950, en hebben vergaande optische metingen, variërend van toepassingen in parasiet groei ^23, aan het documenteren van de celcyclus ²⁴ te onderzoeken membraan dynamiek van rode bloedcellen ²⁵ gemaakt. In het bijzonder, heeft de afgelopen tien jaar een schat aan label-free kwantitatieve microscopie zien in de vorm van diffractie fase microscopie ^26, tomografische fase microscopie ²⁷ digitale holografische microscopie ^28, fase gevoelige optische coherentie microscopie ^29, ruimtelijke licht interferentiemicroscopie ^30, Hilbert fase microscopie ³¹ en kwantitatieve fase microscopie ^32. Ondanks hun gezamenlijke successen, zijn deze instrumenten niet verspreid naar het grotere gebied van biologische onderzoekers gevolg, meestal, hun complexe instrumentatie en computationele vereisten.

Hierin we drenderen het gebruik van een standaard optische microscoop kwantitatieve metingen van gewicht, volume en dichtheid op cellulaire monsters uitgevoerd door een combinatie van helderveld en DIC beelden. Twee primaire benaderingen worden gepresenteerd: noninterferometric kwantitatieve fase microscopie (NIQPM), op de metingen van de totale celmassa en subcellulaire distributie dichtheid te voeren, en Hilbert transformeren differentieel interferentie contrast microscopie (HTDIC), om het volume te bepalen. De belangrijkste voordelen van NIQPM en HTDIC lag in hun technologische toegankelijkheid. De beeldvormende voorwaarden voor de succesvolle uitvoering binnen het bereik van de normale werking van de meeste commercieel beschikbare microscopen. Daarnaast is de post-processing algoritmes zijn stabiel, snel en robuust – hebben in MATLAB geïmplementeerd met behulp van snelle Fourier-transformatie (FFT) gebaseerde algoritmen waar mogelijk.

NIQPM is een methode om fase en de axiaal geïntegreerde massadichtheid van cel reconstruerenlaire exemplaren uit helder veld beeldspraak. Sommatie van deze axiaal geïntegreerd massadichtheid over het gebied van het model geeft de totale droge massa gehalte van het monster. De NIQPM protocol is gebaseerd op de fundamenten van Paganin en Nugent ^{18, 19} experimentele basis – waarbij werd aangetoond dat de fase profiel van een cel kan worden gereconstrueerd door-focus helderveld beeld van het monster – en theoretisch werk van Frank , Altmeyer en Wernicke ²⁰ – op het oplossen van de asparallelle golfmodellen op een efficiënte FFT-gebaseerde manier. De aansluiting van fase naar de droge massa dichtheid is gebaseerd op het werk van Barer ^{10, 11} en Popescu ^33.

Volumetrische informatie kan worden verkregen bij door-focus DIC beelden onder hoge NA verlichting omstandigheden die optische sectie van het monster staat langs de optische as. Hilbert transformatie proces op het DIC afbeelding stapels vergrootranddetectie algoritmen voor het lokaliseren van het monster grenzen in drie dimensies door het scheiden van de grijswaarden van het monster intensiteit van die van de achtergrond. Dit werk is afkomstig van Arinson et al.. ³⁴ hoewel we beiden Fourierfiltering methoden geïntroduceerd om contrast en een Sobel-gebaseerde Edge-detectiemethode voor geautomatiseerde volumetrische analyse van het monster te verbeteren. We hebben ook eerder gevalideerde HTDIC op polystyreen bolletjes variërend in grootte van de diffractie limiet tot 20 urn diameter ^36.

Terwijl zowel NIQPM en HTDIC technologisch toegankelijk vanwege hun ontwikkeling op commerciële microscopen, worden de methoden fundamenteel beperkt door de hardware configuratie van de microscopen zelf. De belangrijkste beperkingen van deze technieken zijn tweeledig: slow z-stack overname tijd op commerciële scopes, als gevolg van de vertaling van het gehele monster etappe in tegenstelling tot enkel het objectief, Beperkt momenteel onderzoek verschijnselen sneller dan ongeveer 1 frame / minuut en tweede diffractie effecten beperken de bruikbaarheid van NIQPM en HTDIC voorwerpen variërend in grootte van 0,2 tot 10 en 20 micrometer in doorsnede, respectievelijk. Daarom moet het model en de bijbehorende tijdsdynamiek plaats aan bepaalde grootte en temporele beperkingen op het gebruik van deze methoden op typische "off-the-shelf" instrumenten mogelijk. Opwindend, zijn de meeste vaste cellulaire exemplaren gemakkelijk onderzocht met deze methoden.

Een overzicht van de NIQPM en HTDIC protocollen zijn aangegeven in figuur 1. In figuur 2 illustreren we optimale en suboptimale door-focus beeldvorming onder zowel lage als hoge NA verlichting voorwaarden voor zowel helderveld en DIC beelden. Figuren 3 en 4 tonen de parameter-afhankelijkheid van de NIQPM algoritme markeren geslaagde en mislukte implementaties. <strong> Figuur 5 illustreert de stappen die betrokken zijn bij de HTDIC beeldverwerking algoritme en toont de optimale uitvoering van het algoritme om cellulaire volume bepalen.

Protocol

1. Microscoop Specificaties Om beeldvorming uit te voeren op de juiste wijze de microscoop moet aan de volgende specificaties: Bezitten zowel differentieel interferentie contrast (DIC) en helderveld (BF) contrast. Laat computergestuurde z-as beweging. Hebben een verstelbare opening halte naar de condensor lens numerieke lensopening te variëren. Een opening met een gegradeerde regel of elektronische uitlezing moet de waarde van de numerieke apertuur kennen. De …

Representative Results

Juiste monster verlichting bij door-aandacht beeld acquisitie is cruciaal voor de succesvolle implementatie van de NIQPM een nd HTDIC algoritmen. In figuur 2 illustreren we lage en hoge NA verlichting zowel onder DIC en helder veld contrast voor een polystyreen bol en de humane colorectale adenocarcinoomcellijn SW620. Figuren 2A, 2C, 2I en 2K demonstreren optimale beeldvorming voor NIQPM. Figuren 2F, 2H, 2N en 2P demonstreren optimale beeldvorming voor …

Discussion

In het algemeen, NIQPM is een buigingsbegrensde techniek gevalideerd op optische pad-lengtes variërend ,25-44,7. Validering werd bij n = 1,596 polystyreen bolletjes variërend in diameter van 0,11-9,8 urn gesuspendeerd in Fluoromount G (gegevens niet getoond). Cellen bezitten optische pad-lengtes die variëren van bijna 0-7.

Bij het meten van de verdeling dichtheid van een monster kan men vinden dat het imago van de pseudo DIC ziet er prima uit, terwijl de kaart dichtheid bezit ongewenste a…

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media