מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי לבצע מדידות כמותיות של מסה, נפח וצפיפות על דגימות סלולריות באמצעות שילוב של שדה בהיר ודימויים התערבות ההפרש לעומת זאת. שתי גישות עיקריות מוצגות: מיקרוסקופיה השלב הכמותי noninterferometric (NIQPM), כדי לבצע מדידות של מסת תא מוחלטת והפצת צפיפות subcellular, והילברט להפוך מיקרוסקופיה התערבות ההפרש לעומת זאת (HTDIC) כדי לקבוע את עוצמת קול. NIQPM מבוסס על מודל פשוט יותר של התפשטות גל, כינה הקירוב הפרקסיאלית, עם שלוש הנחות יסוד: תאורת צמצם מספרי נמוך (NA), פיזור חלש, וקליטה חלשה של אור על ידי הדגימה. למרבה המזל, דגימות סלולריות בלא כתם לספק את ההנחות הללו ותאורת NA נמוכה מושגת בקלות על מיקרוסקופים מסחריים. HTDIC משמש כדי להשיג מידע נפחית מדימויי דסק"ש באמצעות פוקוס תחת illumin NA הגבוהתנאי ation. תאורת NA גבוהה מאפשרת חתך משופר של הדגימה לאורך הציר האופטי. הילברט להפוך עיבוד על תמונת דסק"ש ערימות משפר באופן משמעותי אלגוריתמי גילוי קצה ללוקליזציה של גבולות דגימה בשלושה ממדים על ידי הפרדת הערכים האפורים של עוצמת דגימה מאלה של הרקע. היתרונות העיקריים של NIQPM וHTDIC שכבו בנגישות הטכנולוגית שלהם באמצעות מיקרוסקופים "ה-off-המדף". ישנן שתי מגבלות בסיסיות של שיטות אלה: זמן רכישת Z-מחסנית איטית בטווחים מסחריים כיום מבטל את החקירה של תופעות מהר יותר מאשר 1 מסגרת / דקה, ושנית, השפעות עקיפה להגביל את התועלת של NIQPM וHTDIC לאובייקטים מ0.2 עד 10 (NIQPM) ו20 מיקרומטר (HTDIC) בקוטר, בהתאמה. לפיכך, את דינמיקת הדגימה והזמן הקשורים אליו עניין לעמוד בגודל מסוים ואילוצים של זמן כדי לאפשר את השימוש בשיטות אלה. מרגש cellula, הקבוע ביותרדגימות r נחקרות בקלות עם שיטות אלה.
Introduction
השימוש במיקרוסקופ אופטי הוא בכל מקום בחקירה של אורגניזמים סלולריים עכשיו. בשל מאפייניהם נמוכים אנדוגני הספיגה ופיזור חלש על פני הספקטרום האופטי לעין, תאים אינם בתוקף להשפיע על המשרעת של גלים אופטיים חוצים אותם ובכך מופיעים שקוף למחצה כאשר צילמו עם מיקרוסקופים שדה בהיר סטנדרטיים. דגימות נייד, לעומת זאת, להאט את הגלים אופטיים נסיעה דרכם באופן שקשור באופן ליניארי לכמות צפיפות מסה המקומית באזור מסוים של מרחב שדרכו האור עובר. ניצול של הפיגור הזה הטרוגנית זמן או פרופיל "שלב" של גלים אופטיים מועברים באמצעות דגימות מיקרוסקופיות תואר לראשונה בשנת 1935 ידי פריץ Zernike 1 והבין באופן ניסיוני על ידי Zernikein 1942 2. Zernike זכה בפרס נובל ב -1953 להישג זה. Zeiss ממוסחר שיטה זו בשנת 1945 3. ב1955, סמית וNomarskהייתי להציג את עבודתם הראשונית בשימוש 4 והתאוריה 5 של התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופיה (DIC), שיטה המשתמשת בשיפוע המרחבי של שלב כמנגנון הניגודיות. דסק"ש היה ממוסחר על ידי Zeiss ב1965in שיתוף פעולה הדוק עם Nomarski 6. ב1981, שתי מעבדות הפגינו הדימויים הראשונים נרשמו תא חי דסק"ש עם שילוב של מצלמות וידאו לתוך רכבת האופטיקה של המיקרוסקופ דסק"ש 7, 8. העידן של הדמיה תא חי נולד.
מאז הפעם, הביצוע של שניהם בניגוד השלב ודסק"ש במיקרוסקופים מסחריים היה ללא שינוי במידה רבה. שיטות אלה מנוצלים בעיקר על ידי ביולוגים כדי להפיק תמונות של תאים למטרות איכותיות: ניטור של מורפולוגיה, מעקב של מבני subcellular, וחקירות של דינמיקת קרום 9. טכניקות אלו הן איכותיות בתצורה שלהם "ה-off-המדף" כשתי שלב וDIתמונות C הן פונקציות שרירותיות של עוצמת מקור האור, אופטיקה הגדרות תאורה, ועלייה במצלמת CCD, גמא, והגדרות חשיפה.
לגיון קטן של פיסיקאים ומהנדסים אופטיים השתדל להפוך את שיטות הדמיה מסחריות כמותית. בין המאמצים הראשונים היו שני מכתבים לטבע ב1952 ו1953 שברופא שהפך biophysicist רוברט Barer הפגין את השימוש במיקרוסקופ שלב לקביעת מסה יבשה סלולרית של תאים על ידי אומדן שלב משמרות באמצעות סוגים אלה תא באמצעות מיקרוסקופ שלב זמין מסחרי 10, 11. השדה פיתח מספר רב של טכניקות במהלך השנים שלאחר מכן התבססו סביב שלושה מנגנונים בסיסיים ללא תווית ניגוד: מיקרוסקופיה שלב 10,11, מיקרוסקופיה DIC 12-17, ושדה בהיר 18-22 כדי לקבוע אופטית נתיב באורך, שלב, מסה צפיפות, מקדם שבירה, ונפח תא.
בפסקהllel, אוסף גדול של מכשירים אופטיים מותאמים אישית יש גם פותחו מאז 1950s, והפך את מרחיקת לכת מדידות אופטיות הנעות בין יישומים בצמיחת טפיל 23, לתיעוד מחזור 24 התא לחקירת דינמיקת קרום של תאי דם אדומים 25. בפרט, בעשר השנים האחרונות ראו שפע של מיקרוסקופיה כמותית ללא תווית בצורת מיקרוסקופית שלב עקיפה 26, מיקרוסקופיה שלב טומוגרפית 27, מיקרוסקופיה הולוגרפית הדיגיטלית 28, מיקרוסקופיה קוהרנטיות אופטית רגישה שלב 29, מיקרוסקופיה הפרעות אור מרחבי 30, הילברט שלב 31 במיקרוסקופיה, ומיקרוסקופיה שלב הכמותי 32. למרות ההצלחות הקולקטיביות שלהם, מכשירים אלו לא היו מופצים לשדה הגדול יותר של חוקרים ביולוגיים בשל, בעיקר, למכשור המורכב שלהם ודרישות חישובית.
במסמך זה אנו דescribe השימוש במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי לבצע מדידות כמותיות של מסה, נפח וצפיפות על דגימות סלולריות באמצעות שילוב של שדה בהיר ודימויים דסק"ש. שתי גישות עיקריות מוצגות: מיקרוסקופיה השלב הכמותי noninterferometric (NIQPM), כדי לבצע מדידות של מסת תא מוחלטת והפצת צפיפות subcellular, והילברט להפוך מיקרוסקופיה התערבות ההפרש לעומת זאת (HTDIC), כדי לקבוע את עוצמת קול. היתרונות העיקריים של NIQPM וHTDIC שכבו בנגישות הטכנולוגית שלהם. תנאי ההדמיה הנדרשים לביצוע המוצלח שלהם במסגרת פעולה הרגילה של רוב המיקרוסקופים זמינים מסחרי. בנוסף, האלגוריתמים שלאחר העיבוד הם יציבים, מהירים, וחזקים – שיושם בMATLAB באמצעות פורייה מהיר להפוך אלגוריתמים מבוססים (FFT) בכל ההזדמנות אפשרית.
NIQPM היא שיטה לשחזר שלב וצפיפות המסה המשולבת axially של celדגימות lular מדימויי שדה בהירים. סיכום של צפיפות מסה משולבת axially זה על פני השטח של הדגימה נותן תוכן המסה היבש הכולל של הדגימה. פרוטוקול NIQPM מבוסס על היסודות שהונחו על ידי הניסיוניים Paganin ו18 נוג'נט, 19 – שבו הוכיח כי פרופיל השלב של תא יכול להיות משוחזר מדימויי שדה בהיר דרך הפוקוס של המדגם – והעבודה התיאורטית של פרנק , Altmeyer, ו20 רניקה – בפתרון המודלים גל הפרקסיאלית באופן מבוסס FFT יעיל. החיבור של שלב לצפיפות המסה היבשה מבוסס על העבודה על ידי 10 Barer, 11 ופופסקו 33.
ניתן לקבל מידע נפחית מדימויי דסק"ש באמצעות פוקוס בתנאי תאורת NA גבוהים המאפשרים חתך אופטי של הדגימה לאורך הציר האופטי. הילברט להפוך עיבוד על ערימות תמונת דסק"ש משפר באופן משמעותיאלגוריתמי גילוי קצה ללוקליזציה של גבולות דגימה בשלושה ממדים על ידי הפרדת הערכים האפורים של עוצמת דגימה מאלה של הרקע. עבודה זו מקורו בArinson et al. 34 למרות שאנחנו הצגנו שני שיטות הסינון פורייה כדי לשפר את הניגודיות ושיטת גילוי קצה מבוססת סובל לניתוח נפח אוטומטי של המדגם. גם יש לנו תוקף HTDIC בעבר בתחומי קלקר החל בגודל גבול ההשתברות עד 20 מיקרומטר בקוטר 36.
בעוד שני NIQPM וHTDIC הם מבחינה טכנולוגית נגישים בשל התפתחותם במיקרוסקופים מסחריים, השיטות מוגבלות ביסודה על ידי תצורת החומרה של המיקרוסקופים עצמם. המגבלות העיקריות של טכניקות אלה הן כפולה: זמן רכישת Z-מחסנית איטית בטווחים מסחריים, הנובע מתרגום של שלב המדגם כולו בניגוד לסתם העדשה האובייקטיבית, כיום מגביל את החקירה של תופעות מהר יותר מאשר בערך 1 מסגרת / דקה, ושנית, השפעות עקיפה להגביל את התועלת של NIQPM וHTDIC לאובייקטים הנעים בגודל 0.2 עד 10 ו20 מיקרומטר בקוטר, בהתאמה. לפיכך, את הדגימה ודינמיקת הזמן הקשור של ריבית חייבת לעמוד בגודל מסוים ואילוצים של זמן כדי לאפשר את השימוש בשיטות אלה על מכשירים טיפוסיים "ה-off-המדף". בהתלהבות, רוב הדגימות סלולריות קבועות נחקרות בקלות עם שיטות אלה.
סקירה של NIQPM ופרוטוקולי HTDIC ניתנת באיור 1. באיור 2 אנו מדגימים הדמיה באמצעות פוקוס אופטימלי והכי מוצלחת בתנאי תאורת NA הן נמוכים וגבוהים עבור שניהם בשדה בהיר ודימויים דסק"ש. איורים 3 ו -4 להדגים את תלות הפרמטר של אלגוריתם NIQPM הדגשת מימושים מוצלחים ולא מוצלחים. <strong> איור 5 מדגים את השלבים כרוכים באלגוריתם עיבוד התמונה HTDIC ומדגים את היישום האופטימלי של האלגוריתם כדי לקבוע נפח סלולארי.
Protocol
Representative Results
Discussion
באופן כללי, NIQPM היא טכניקה עקיפה מוגבל תוקף על נתיב אורכים אופטיים הנעים 0.25-44.7. אימות בוצעה על n = 1.596 תחומים קלקר הנעים בקוטר .11-9.8 מיקרומטר המושעה בFluoromount G (מידע לא מוצגים). תאים בעלי נתיב אורכים אופטיים הנעים בין כמעט 0-7.
כאשר מודד את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (U54CA143906 לKGP, OJTM וR01HL101972 לOJTM) וקרן מחקר רפואית אורגון פרס חוקר מוקדם קליני (KGP). OJTM הוא חוקר של איגוד לב האמריקאי שהוקם (13EIA12630000). אנו מודים לד"ר אריק אנדרסון של אביר מכון הסרטן להכנת דגימות תאים המשמשות בעבודה זו.
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
References
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
- Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
- Smith, F. H. . Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
- Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
- Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
- Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
- Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
- Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
- Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
- Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
- Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
- Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
- Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
- Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
- Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
- Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
- Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
- Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
- Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
- Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
- Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
- Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
- Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
- Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
- Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
- Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
- Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
- Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
- Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
- Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
- Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
- Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
- Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).
