Kvantitativ optisk mikroskopi: Mätning av Cellular biofysikalisk funktioner med en standard optisk mikroskop
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
Vi beskriver användning av en vanlig optiskt mikroskop för att utföra kvantitativa mätningar av massa, volym och densitet på cellprover genom en kombination av ljusa fält och differential interferens kontrast bildspråk. Två primära ansatser presenteras: noninterferometric kvantitativ fas mikroskopi (NIQPM), för att utföra mätningar av total cellmassa och subcellulära densitetsfördelning, och Hilbert trans differential interferens kontrast mikroskopi (HTDIC) för att bestämma volymen. NIQPM bygger på en förenklad modell av vågutbredning, benämnd paraxiala approximation, med tre underliggande antaganden: låg numerisk apertur (NA) belysning, svag spridning och svagt ljus absorberas av provet. Lyckligtvis ofärgade cellprover uppfyller dessa antaganden och låg NA belysning är lätt uppnås på kommersiella mikroskop. HTDIC används för att få volymetriska information från genom-fokus DIC bildspråk under högt NA Illumination förhållanden. Hög NA belysning möjliggör förbättrad sektione av provet längs den optiska axeln. Hilbert trans behandling på DIC bilden stackar kraftigt förbättrar kantdetekteringsalgoritmer för lokalisering av prov gränser i tre dimensioner genom att separera de grå värden för provintensiteten från dem i bakgrunden. De främsta fördelarna med NIQPM och HTDIC låg i sin tekniska tillgängligheten med hjälp av "off-the-shelf" mikroskop. Det finns två grundläggande begränsningar av dessa metoder: slow z-stack förvärvstiden på kommersiella omfattningar upphäver nu utredningen av fenomen snabbare än 1 frame / minut, och för det andra, diffraktionseffekter begränsar nyttan av NIQPM och HTDIC till objekt från 0,2 upp till 10 (NIQPM) och 20 (HTDIC) im i diameter, respektive. Därför måste provet och dess tillhörande tidsdynamik intresse möta viss storlek och tidsmässiga begränsningar för att möjliggöra användning av dessa metoder. Spännande, de flesta fasta cellular exemplar lätt undersökas med dessa metoder.
Introduction
Användning av optisk mikroskopi är nu överallt i utredningen av cellulära organismer. På grund av deras låga endogena absorbans och svag spridande egenskaper över det synliga optiska spektrumet, har cellerna inte starkt påverkar amplituden av optiska vågor som trafikerar dem och på så sätt verkar halv när avbildas med vanliga ljusa fält mikroskop. Cellulära prover gör dock bromsa optiska vågor som färdas genom dem på ett sätt som är linjärt relaterad till mängden av lokala massdensitet i en speciell region av utrymme genom vilket ljus färdas. Utnyttjande av denna heterogena tidsfördröjning eller "fas" profil för optiska vågor som sänds genom mikroskopiska prover beskrevs första gången 1935 av Frits Zernike 1 och experimentellt realiseras av Zernikein 1942 2. Zernike fick Nobelpriset 1953 för denna bedrift. Zeiss kommersialiserade denna stödform 1945 3. 1955, Smith och NomarskJag skulle presentera sitt inledande arbete om användningen 4 och teori 5 av differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, en modalitet som använder den rumsliga gradienten av fas som en kontrast mekanism. DIC kommersialiserades av Zeiss i 1965in nära samarbete med Nomarski 6. År 1981, två laboratorier visade den första inspelade levande cell DIC bildspråk med införlivandet av videokameror i optik tåget av DIC mikroskop 7, 8. En tid präglad av levande cell imaging föddes.
Sedan dess har utförandet av både faskontrast och DIC på kommersiella mikroskop i stort sett varit oförändrad. Dessa metoder är huvudsakligen används av biologer för att producera bilder av celler för kvalitativa syften: övervakning av morfologi, spårning av subcellulära strukturer, och undersökningar av membrandynamik 9. Dessa tekniker är kvalitativ i deras "off-the-shelf"-konfiguration som både fas och DIC-bilder är godtyckliga funktioner av ljuskällan intensitet, optiken inställningar belysning, och CCD-kamera vinst, gamma, och exponeringsinställningar.
En liten legion av fysiker och optiska ingenjörer har strävat efter att göra kommersiella avbildningsmetoder kvantitativ. Bland de första försök var två brev till naturen i 1952 och 1953 där läkaren som blev biofysiker Robert Barer visat att användningen av fas mikroskopi för att bestämma celltorrvikt celler genom att uppskatta fasförskjutningar genom dessa celltyper med hjälp av en kommersiellt tillgänglig fas mikroskop 10, 11. Fältet har utvecklat en mångfald av tekniker under de följande åren uppbyggd kring tre grundläggande märkningsfria kontrastmekanismer: fas mikroskopi 10,11, DIC mikroskopi 12-17, och ljusa fält 18-22 för att bestämma optisk väg-längd, fas, mass densitet, brytningsindex, och cellulär volym.
I parallel, en stor samling av anpassade optiska instrument har också utvecklats sedan 1950-talet, och har gjort långtgående optiska mätningar allt från applikationer i parasittillväxten 23, att dokumentera cellcykeln 24 att utreda membran dynamiken i röda blodkroppar 25. Framför allt har de senaste tio åren sett en uppsjö av etikett-fri kvantitativ mikroskopi i form av diffraktion fas mikroskopi 26, tomografisk fas mikroskopi 27, digital holografisk mikroskopi 28, fas känslig optisk koherens mikroskopi 29, Spatial Light störningar mikroskopi 30, Hilbert fasmikroskopi 31, och kvantitativ fas-mikroskopi 32. Trots deras kollektiva framgångar, har dessa instrument inte spridits till det större området biologiska forskare som grund, för det mesta, till deras komplexa instrument och beräkningskraven.
Häri vi describe att använda en vanlig optiskt mikroskop för att utföra kvantitativa mätningar av massa, volym och densitet på cellprover genom en kombination av ljusa fält och DIC bildspråk. Två primära metoder presenteras: noninterferometric kvantitativ fas-mikroskopi (NIQPM), för att utföra mätningar av den totala cellmassan och subcellulära fördelningen densitet och Hilbert-trans differentiell interferenskontrast mikroskopi (HTDIC), för att bestämma volymen. De främsta fördelarna med NIQPM och HTDIC låg i sin tekniska tillgängligheten. De avbildnings villkor som krävs för ett framgångsrikt genomförande ligger inom ramen för normal drift av de flesta kommersiellt tillgängliga mikroskop. Dessutom är efterbehandlings algoritmer är stabil, snabb och robust – efter att ha implementerats i MATLAB med hjälp av snabb Fouriertransform (FFT) baserade algoritmer när det är möjligt.
NIQPM är en metod för att rekonstruera fasen och den axiellt integrerad massdensitet av cellular exemplar från ljusa fält bildspråk. Summering av detta axiellt integrerade massa densitet över området av provet ger den totala torrvikt halt av provet. Den NIQPM Protokollet är baserat på de experimentella grunden lagts av Paganin och Nugent 18, 19 – där det visades att fasen profilen för en cell kan rekonstrueras från genom-fokus ljusa fält bilder av provet – och det teoretiska arbetet av Frank , Altmeyer, och Wernicke 20 – på att lösa de axelparallella våg modellerna på ett effektivt FFT-baserade sätt. Anslutningen av fasen till den torra massdensitet är baserad på arbete av Barer 10, 11 och Popescu 33.
Volumetric information kan erhållas från genom-fokus DIC bildspråk under höga NA belysningsförhållanden som möjliggör optisk sektionering av provet längs den optiska axeln. Hilbert trans bearbetning på DIC bildstaplar kraftigt förbättrarkantdetekteringsalgoritmer för lokalisering av de preparat gränser i tre dimensioner genom att separera de gråa värdena för provet intensiteten från de hos bakgrunden. Detta arbete har sitt ursprung med Arinson et al. 34 även om vi har infört både Fourier filtreringsmetoder för att öka kontrasten och en Sobel-baserade kantdetekteringsmetod för automatiserad volyme analys av provet. Vi har även validerat HTDIC tidigare på sfärer polystyren varierar i storlek från diffraktionsgränsen upp till 20 nm i diameter 36.
Medan både NIQPM och HTDIC är tekniskt tillgängliga på grund av sin utveckling på kommersiella mikroskop, är de metoder som i grunden begränsas av hårdvarukonfigurationen av mikroskop själva. De primära begränsningar av dessa tekniker är tvåfaldigt: slow z-stack förvärvstiden på kommersiella tillämpningsområden, till följd av omräkning av hela provet scenen och inte bara objektiv, Begränsar för närvarande utredningen av fenomen snabbare än ungefär 1 bild / minut, och för det andra, diffraktionseffekter begränsar nyttan av NIQPM och HTDIC till objekt som varierar i storlek från 0,2 upp till 10 och 20 nm i diameter. Därför måste provet och dess tillhörande tidsdynamik av intresse möta viss storlek och tidsmässiga begränsningar för att möjliggöra användning av dessa metoder på typiska "off-the-shelf" instrument. Spännande, de flesta fasta cellulära prover lätt undersökas med dessa metoder.
En översikt av NIQPM och HTDIC protokoll ges i figur 1. I figur 2 illustrerar vi optimal och suboptimal genom-fokus avbildning i både låg och hög NA belysningsförhållanden för både ljusa fält och DIC bildspråk. Figur 3 och 4 visar parameterberoendet av NIQPM algoritmen lyfta lyckade och misslyckade implementeringar. <strong> Figur 5 illustrerar de steg som ingår i HTDIC bildbehandlingsalgoritm och visar den optimala tillämpningen av algoritmen för att bestämma cellvolym.
Protocol
Representative Results
Discussion
I allmänhet är NIQPM en diffraktionsbegränsad teknik kontrollerats den optiska väg-längden varierar från 0,25 till 44,7. Validering utfördes på n = 1,596 sfärer polystyren varierar i diameter från 0,11 till 9,8 | im suspenderades i Fluoromount G (data ej visade). Celler har optisk väg-längder som sträcker sig från nästan 0-7.
Vid mätning av fördelningen av ett exemplar täthet man kan finna att den pseudo DIC bilden ser bra ut medan tätheten kartan besitter oönskade bakgru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (U54CA143906 till KGP, OJTM och R01HL101972 till OJTM) och en Oregon Medical Research Foundation Early Clinical Investigator Award (KGP). OJTM är en American Heart Association Etablerad Utredare (13EIA12630000). Vi tackar Dr Eric Anderson i Knight Cancer Institute för att förbereda cellprover som används i detta arbete.
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
References
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
- Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
- Smith, F. H. . Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
- Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
- Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
- Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
- Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
- Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
- Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
- Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
- Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
- Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
- Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
- Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
- Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
- Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
- Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
- Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
- Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
- Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
- Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
- Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
- Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
- Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
- Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
- Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
- Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
- Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
- Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
- Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
- Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
- Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
- Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).
