هندسة المستندة إلى الليفين يبني الأنسجة من Myofibroblasts وتطبيق القيود والضغط للحث على تنظيم الخلايا والكولاجين (إعادة)
Summary
يبدأ هذا النظام نموذج من هلام الليفين الأرومة الليفية العضلية بالسكان والتي يمكن استخدامها لدراسة الكولاجين الذاتية (إعادة) تنظيم الوقت الحقيقي بطريقة غير تدميري. في النظام النموذجي هو الانضباطي جدا، كما يمكن استخدامه مع مصادر مختلفة من الخلايا، والمضافات المتوسطة، ويمكن أن تتكيف بسهولة لتلبية احتياجات محددة.
Abstract
يمكن أن يتأثر محتوى الكولاجين ومنظمة في تطوير الأنسجة كولاجيني من قبل سلالات الأنسجة المحلية والقيد الأنسجة. تهدف المهندسين الأنسجة لاستخدام هذه المبادئ من أجل إنتاج أنسجة الكولاجين مع أبنية محددة مسبقا. الفهم الكامل من العمليات الأساسية الدقيق إعادة عرض الكولاجين للسيطرة على الهندسة المعمارية النسيج النهائي، ومع ذلك، هو غير موجود. على وجه الخصوص، لا يعرف إلا القليل حول (إعادة) التوجه من ألياف الكولاجين في استجابة للتغيرات في الأنسجة الأحكام تحميل الميكانيكية. قمنا بتطوير نظام نموذجي في المختبر، والتي تتكون من ثنائية المحور مقيدة الأرومة الليفية العضلية المصنفة يبني الليفين، لمزيد من توضيح الكولاجين (RE) التوجه استجابة لط) العودة إلى ذو محورين ذو محورين ظروف التحميل ثابت والثاني) دوري جار أحادي المحور من ثنائية المحور مقيدة بنيات قبل وبعد التغيير في اتجاه التحميل، مع استخدام فليكسسيل FX4000T الجهاز تحميل. ويستخدم الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر إلى السادسsualize الكولاجين (RE) التوجه بطريقة غير تدميري.
يمكن أن الخلايا والكولاجين المنظمة في بنيات يمكن تصور في الوقت الحقيقي، ونظام المرجعية الداخلية يسمح لنا للانتقال الخلايا والهياكل الكولاجين لتحليل الوقت الفاصل. ويمكن تعديل جوانب مختلفة من النظام النموذجي، مثل مصدر الخلية أو استخدام الخلايا السليمة والمريضة. إضافات يمكن استخدامها لمزيد من توضيح الآليات الكامنة وراء إعادة تشكيل الكولاجين، من خلال على سبيل المثال تقوم ال MMPs إضافة أو حجب integrins. شكل وحجم بناء يمكن تكييفها بسهولة لاحتياجات محددة، مما أدى إلى النظام النموذجي الانضباطي للغاية لدراسة الخلايا والكولاجين (RE) منظمة.
Introduction
أنسجة القلب والأوعية الدموية لديهم وظيفة بارزة الحاملة. في محتوى معين وتنظيم ألياف الكولاجين في المصفوفة خارج الخلية تساهم في خصائص الحاملة وتهيمن قوة الأنسجة الشاملة 1. في هندسة الأنسجة ويستخدم تكييف الميكانيكية للبناء – التي تتكون عادة من (دوري) اجهاد نظم – لتحسين وتنظيم الأنسجة والخواص الميكانيكية 2،3. لم يتم حتى الآن تحقيق الفهم الكامل لمنظمة الكولاجين سلالة المستحث في هندستها الأنسجة المعقدة من أجل إنتاج أنسجة الكولاجين مع بنية محددة مسبقا. ويرجع ذلك أساسا إلى معرفتنا محدودة من إعادة عرض الكولاجين في الأنسجة النامية. النماذج الحالية تعطي أساسا من المعلومات حول نتائج صافي النهائية من إعادة عرض الكولاجين مع استخدام الضغط ثابت 4-6. هنا نقدم نموذج النظام الانضباطي للغاية التي تسمح للدراسة من الكولاجين (RE) منظمة بطريقة في الوقت الحقيقي، في 3D، تحت تأثيرمن سلالة ثابت أو دوري. بنيات الأنسجة هي المستندة إلى الليفين، وضمان أن جميع الكولاجين في بناء لأمر الذاتية. الخلايا والكولاجين المنظمة في بنيات هو تصور، ونظام المرجعية الداخلية يسمح لنا للانتقال الخلايا والهياكل الكولاجين لتحليل الوقت الفاصل. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح استخدام نظام نموذجي للخلايا الإنسان فينا الصافن (HVSCs)، منذ وتعرف هذه الخلايا لتعزيز إنتاجها من خارج الخلوية مصفوفة والقدرة لإعادة المصفوفة واستخدامنا أنشئت في أنسجة القلب والأوعية الدموية المهندسة 7، استنادا عن أعمال دي جونغ وآخرون. 8
Protocol
Representative Results
Discussion
نظام النموذج الموصوف من بنيات الليفين خلية بالسكان لديها امكانات كبيرة لدراسة الخلايا والكولاجين (RE) منظمة (دي جونغ وآخرون. 15)، على سبيل المثال لاستخدامها لأغراض هندسة الأنسجة. باستخدام الليفين باعتبارها الناقل الخلية الأولي، بعد تدهور الليفين، يتم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أجريت هذه الدراسة في برنامج البحوث من المواد الطبية الحيوية (BMM) معهد. وcofunded BMM من قبل وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية والزراعة والابتكار. ومن المسلم به بامتنان المساهمة المالية من Hartstichting NEDERLANDSE.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
