Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

Summary

Este modelo de sistema começa a partir de um gel de fibrina miofibroblastos povoada que pode ser usado para estudar colagénio endógeno (re) organização em tempo real de uma forma não destrutiva. O modelo de sistema é muito sintonizável, como ele pode ser usado com diferentes fontes de células, aditivos médio, e pode ser facilmente adaptada às necessidades específicas.

Abstract

Conteúdo de colágeno e organização no desenvolvimento de tecidos de colágeno pode ser influenciada por cepas do tecido local e restrição dos tecidos. Engenheiros de tecidos pretendem usar esses princípios para criar tecidos com arquiteturas de colágeno pré-definidos. A plena compreensão dos processos subjacentes exatas de remodelação do colágeno para controlar a arquitetura do tecido final, no entanto, é inexistente. Em particular, pouco se sabe sobre a orientação a (re) das fibras de colagénio, em resposta a alterações nas condições de carga mecânica dos tecidos. Nós desenvolvemos um sistema em modelo in vitro, que consiste em biaxialmente limitados miofibroblastos semeado construções de fibrina, para elucidar ainda mais colágeno (re) orientação em resposta ao i) reversão biaxial para condições de carga estática uniaxiais e ii) carga cíclica uniaxial do biaxialmente constrangido construções, antes e depois de uma mudança de direcção de carga, com a utilização do dispositivo de carregamento FX4000T Flexcell. Time-lapse confocal de imagem é utilizado para visualize colagénio (re) orientação de uma maneira não destrutiva.

Organização celular e colágeno nas construções podem ser visualizados em tempo real, e um sistema de referência interna nos permite mudar as células e estruturas de colágeno para a análise de lapso de tempo. Vários aspectos do sistema do modelo podem ser ajustados, como fonte de células ou a utilização de células saudáveis ​​e doentes. Aditivos podem ser utilizados para elucidar os mecanismos subjacentes a remodelação do colagénio, por exemplo, por adição de MMPs ou bloqueio integrinas. A forma eo tamanho da construção pode ser facilmente adaptada para necessidades específicas, resultando em um sistema modelo altamente ajustável para o estudo de células e colagénio (re) organização.

Introduction

Tecidos cardiovasculares têm uma função de suporte de carga de destaque. Em particular, o conteúdo ea organização das fibras de colágeno na matriz extracelular contribuem para as propriedades de suporte de carga e dominar a força do tecido total ^1. Na engenharia de tecidos condicionado mecânica da construção é usada – geralmente constituídos por (cíclica) regimes esforçando – para melhorar a organização do tecido e propriedades mecânicas ^2,3. Entendimento completo da organização do colagénio induzida por deformação em geometrias complexas para criar tecidos tecidos de colagénio com uma arquitectura predefinida ainda não foi alcançada. Isto é principalmente devido ao nosso conhecimento limitado de remodelação do colágeno nos tecidos em desenvolvimento. Modelos existentes, principalmente, dar informações sobre o resultado líquido final de remodelação do colágeno com o uso de pressão estática ^4-6. Aqui nós fornecemos um sistema modelo altamente ajustável que permite o estudo da organização do colagénio (re) de uma forma em tempo real, em 3D, sob influênciada estirpe estático ou cíclico. As construções de tecido são à base de fibrina, assegurando que toda colagénio no construto é endógena. Organização celular e colágeno nas construções é visualizado, e um sistema de referência interna nos permite mudar as células e estruturas de colágeno para a análise de time-lapse. Neste protocolo, iremos descrever o uso do sistema de modelo de veia safena Humanos Células (HVSCs), uma vez que estas células são conhecidos pela sua produção aumentada de matriz extracelular e capacidade para remodelar a matriz e a utilização conhecida em engenharia de tecidos cardiovasculares ^7, baseado na obra de Jonge et al. ^oito

Protocol

1. Cultura de células humanas veia safena Isolar células da veia safena magna, adquirido a partir de um doador de acordo com as orientações para utilização de material secundário, de acordo com o protocolo de Schnell et ai. 9 e armazená-las em azoto líquido. A partir da parte da veia safena magna peças cortadas a partir de um doador de 2 x 2 mm a cultura numa placa de seis poços. Use dois pedaços por poço. Geralmente, as células podem ser obtidas suficientes para encher frasc…

Representative Results

Este modelo de sistema permite a cultura myofibroblast-semeados gel de fibrina. Figura 1A mostra um tecido cultivado pela primeira vez sob restrições biaxiais estáticas. Constrangimentos de tecido são libertadas por corte do gel de fibrina a partir de duas restrições, para criar restrições estáticas uniaxiais e compacta do tecido e remodela depois (Figura 1A). Para estirpe cíclico, o tecido é cultivada sob constrangimentos biaxiais estáticos também. Após 5 dias de tensão …

Discussion

O sistema modelo descrito de construções de fibrina por células povoadas tem um grande potencial para o estudo de células e colagénio (re) organização (De Jonge et ai. ^15), por exemplo, para ser utilizado para fins de engenharia de tecidos. Ao usar fibrina, como o transportador inicial da célula, depois da degradação da fibrina, um tecido é criado com apenas células e matriz endógena. Desta forma, as células são estimuladas para reagir à tensão, estático ou de natureza cíc…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation