Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce
Summary
Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.
Abstract
Collageen inhoud en organisatie bij de ontwikkeling van collagene weefsels kan worden beïnvloed door lokale weefsel stammen en weefsel beperking. Weefselingenieurs doel om deze principes te gebruiken om weefsels te creëren met voorgedefinieerde collageen architecturen. Een volledig begrip van het exacte onderliggende processen van collageen remodelleren de definitieve weefselarchitectuur controle echter ontbreekt. In het bijzonder weinig bekend over de (her) oriëntatie van de collageenvezels in reactie op veranderingen in weefsel mechanische belastingscondities. We ontwikkelden een in vitro modelsysteem bestaande uit biaxiaal constrained myofibroblast-gezaaide constructen fibrine, collageen verder te ontrafelen (her) oriëntatie in reactie op i) terugkeer naar biaxiale eenassige statische belastingsomstandigheden en ii) uniaxiale cyclische belasting van de biaxiaal beperkt constructen voor en na een verandering in belastingsrichting, met gebruik van de Flexcell FX4000T laadinrichting. Time-lapse confocale beeldvorming wordt gebruikt om visualize collageen (her) oriëntatie op een niet-destructieve manier.
Cel en collageen organisatie in de constructen kunnen worden gevisualiseerd in real-time, en een interne referentie systeem stelt ons in staat om te verhuizen cellen en collageen structuren voor time-lapse-analyse. Verschillende aspecten van het model systeem kan worden aangepast, zoals mobiele bron of het gebruik van gezonde en zieke cellen. Additieven kunnen worden gebruikt om verder te verhelderen mechanismen onderliggende collageen remodelleren, bijvoorbeeld door toevoegen van MMPs of blokkering integrinen. Vorm en grootte van de construct kan gemakkelijk worden aangepast aan de specifieke behoeften, wat resulteert in een zeer regelbaar modelsysteem cel en collageen (re) organisatie bestuderen.
Introduction
Cardiovasculaire weefsels hebben een prominente dragende functie. In het bijzonder de inhoud en organisatie van collageenvezels in de extracellulaire matrix bijdragen aan de dragende eigenschappen en domineren algehele weefsel sterkte 1. In tissue engineering mechanische conditionering van het construct wordt gebruikt – meestal bestaande uit (cyclische) uitpersen regimes – om weefsel organisatie en mechanische eigenschappen 2,3 versterken. Volledig begrip van stam-geïnduceerde collageen organisatie in complex weefsel geometrieën weefsels voorgedefinieerde collageen architectuur maakt is nog niet bereikt. Dit is voornamelijk te wijten aan onze beperkte kennis van collageen remodeling in het ontwikkelen van weefsels. Bestaande modellen geven vooral informatie over de uiteindelijke netto resultaat van collageen remodeling met gebruik van statische belasting 4-6. Hier bieden we een zeer afstembare modelsysteem dat de studie van collageen (re) organisatie maakt in een real-time mode, in 3D, onder invloedvan statische of cyclische belasting. Het weefsel constructen fibrine-based, zodat alle collageen in het construct is endogeen. Cel en collageen organisatie in de constructies wordt gevisualiseerd, en een interne referentie systeem stelt ons in staat om te verhuizen cellen en collageen structuren voor time-lapse-analyse. In dit protocol wordt het gebruik van het model voor Human Vena saphena Cells (HVSCs) beschrijven, aangezien deze cellen staan bekend om hun toegenomen extracellulaire matrix productie en de mogelijkheid om de matrix en ons langdurig gebruik in cardiovasculaire weefsels gemanipuleerde 7 verbouwen, gebaseerd over het werk van de Jonge et al.. 8
Protocol
Representative Results
Discussion
Het beschreven modelsysteem cel-bevolkte fibrine constructen grote mogelijkheden voor de studie van de cel en collageen (her) inrichting (de Jonge et al.. 15), bijvoorbeeld te gebruiken voor weefselregeneratie doeleinden. Door het gebruik van fibrine als de oorspronkelijke cel vervoerder, na fibrine degradatie, wordt een weefsel gemaakt met cellen en slechts endogene matrix. Op deze wijze worden cellen gestimuleerd om te reageren op spanning, statisch of cyclisch van aard, door toepassing co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd uitgevoerd in het onderzoeksprogramma van het BioMedical Materials (BMM) instituut. BMM wordt medegefinancierd door het Nederlandse Ministerie van Economische Zaken, Landbouw en Innovatie. De financiële bijdrage van de Nederlandse Hartstichting is dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
