Summary
يبدأ هذا النظام نموذج من هلام الليفين الأرومة الليفية العضلية بالسكان والتي يمكن استخدامها لدراسة الكولاجين الذاتية (إعادة) تنظيم الوقت الحقيقي بطريقة غير تدميري. في النظام النموذجي هو الانضباطي جدا، كما يمكن استخدامه مع مصادر مختلفة من الخلايا، والمضافات المتوسطة، ويمكن أن تتكيف بسهولة لتلبية احتياجات محددة.
Abstract
يمكن أن يتأثر محتوى الكولاجين ومنظمة في تطوير الأنسجة كولاجيني من قبل سلالات الأنسجة المحلية والقيد الأنسجة. تهدف المهندسين الأنسجة لاستخدام هذه المبادئ من أجل إنتاج أنسجة الكولاجين مع أبنية محددة مسبقا. الفهم الكامل من العمليات الأساسية الدقيق إعادة عرض الكولاجين للسيطرة على الهندسة المعمارية النسيج النهائي، ومع ذلك، هو غير موجود. على وجه الخصوص، لا يعرف إلا القليل حول (إعادة) التوجه من ألياف الكولاجين في استجابة للتغيرات في الأنسجة الأحكام تحميل الميكانيكية. قمنا بتطوير نظام نموذجي في المختبر، والتي تتكون من ثنائية المحور مقيدة الأرومة الليفية العضلية المصنفة يبني الليفين، لمزيد من توضيح الكولاجين (RE) التوجه استجابة لط) العودة إلى ذو محورين ذو محورين ظروف التحميل ثابت والثاني) دوري جار أحادي المحور من ثنائية المحور مقيدة بنيات قبل وبعد التغيير في اتجاه التحميل، مع استخدام فليكسسيل FX4000T الجهاز تحميل. ويستخدم الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر إلى السادسsualize الكولاجين (RE) التوجه بطريقة غير تدميري.
يمكن أن الخلايا والكولاجين المنظمة في بنيات يمكن تصور في الوقت الحقيقي، ونظام المرجعية الداخلية يسمح لنا للانتقال الخلايا والهياكل الكولاجين لتحليل الوقت الفاصل. ويمكن تعديل جوانب مختلفة من النظام النموذجي، مثل مصدر الخلية أو استخدام الخلايا السليمة والمريضة. إضافات يمكن استخدامها لمزيد من توضيح الآليات الكامنة وراء إعادة تشكيل الكولاجين، من خلال على سبيل المثال تقوم ال MMPs إضافة أو حجب integrins. شكل وحجم بناء يمكن تكييفها بسهولة لاحتياجات محددة، مما أدى إلى النظام النموذجي الانضباطي للغاية لدراسة الخلايا والكولاجين (RE) منظمة.
Introduction
أنسجة القلب والأوعية الدموية لديهم وظيفة بارزة الحاملة. في محتوى معين وتنظيم ألياف الكولاجين في المصفوفة خارج الخلية تساهم في خصائص الحاملة وتهيمن قوة الأنسجة الشاملة 1. في هندسة الأنسجة ويستخدم تكييف الميكانيكية للبناء - التي تتكون عادة من (دوري) اجهاد نظم - لتحسين وتنظيم الأنسجة والخواص الميكانيكية 2،3. لم يتم حتى الآن تحقيق الفهم الكامل لمنظمة الكولاجين سلالة المستحث في هندستها الأنسجة المعقدة من أجل إنتاج أنسجة الكولاجين مع بنية محددة مسبقا. ويرجع ذلك أساسا إلى معرفتنا محدودة من إعادة عرض الكولاجين في الأنسجة النامية. النماذج الحالية تعطي أساسا من المعلومات حول نتائج صافي النهائية من إعادة عرض الكولاجين مع استخدام الضغط ثابت 4-6. هنا نقدم نموذج النظام الانضباطي للغاية التي تسمح للدراسة من الكولاجين (RE) منظمة بطريقة في الوقت الحقيقي، في 3D، تحت تأثيرمن سلالة ثابت أو دوري. بنيات الأنسجة هي المستندة إلى الليفين، وضمان أن جميع الكولاجين في بناء لأمر الذاتية. الخلايا والكولاجين المنظمة في بنيات هو تصور، ونظام المرجعية الداخلية يسمح لنا للانتقال الخلايا والهياكل الكولاجين لتحليل الوقت الفاصل. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح استخدام نظام نموذجي للخلايا الإنسان فينا الصافن (HVSCs)، منذ وتعرف هذه الخلايا لتعزيز إنتاجها من خارج الخلوية مصفوفة والقدرة لإعادة المصفوفة واستخدامنا أنشئت في أنسجة القلب والأوعية الدموية المهندسة 7، استنادا عن أعمال دي جونغ وآخرون. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة الإنسان فينا خلايا الصافن
- عزل الخلايا من الوريد الصافن الكبير، تم الحصول عليها من إحدى الجهات المانحة وفقا لمبادئ توجيهية لاستخدام المواد الثانوية، وفقا للبروتوكول من قبل شنيل وآخرون. 9 وتخزين هذه في النيتروجين السائل. من جزء من الوريد الصافن الكبير من واحد قطع قطعة المانحة من 2 × 2 ملم إلى ثقافة في لوحة ستة جيدا. استخدام 2 قطعة لكل بئر. ويمكن الحصول على ما يكفي من خلايا عموما لملء حوالي 3 قوارير مع 0.25 × 10 6 خلايا في النيتروجين السائل. وتتميز HVSCs كما myofibroblasts، من خلال إظهار التعبير عن vimentin، لا التعبير عن desmin وجزء من السكان معربا عن α العضلات الملساء أكتين 10. المقبل بدء بروتوكول لذوبان الجليد الخلايا من النيتروجين السائل لزيادة عدد الخلايا.
- وضع الخلايا من قارورة واحدة إلى T75 الأنسجة قارورة الثقافة وتضيف المتوسطة النمو (GM)، التي تتألف من المتقدم DMEM، 50 مل مصل بقري جنيني (FBS)، 5 مل البنسلين /الستربتوميسين و 5 مل L-glutamax. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
- تنمو الخلايا متموجة تقريبا بعد 14 يوما. مخزن 0.5 × 10 6 خلايا في قارورة واحدة في النيتروجين السائل، ويشار إلى مرور 1.
ملاحظة: تجميد الخلايا ليست ضرورية عندما حصاد HVSCs، ولكنها تستخدم فقط للتخزين.
- وضع HVSCs من قنينة واحدة في T175 الأنسجة قارورة الثقافة وإضافة GM. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. تنمو الخلايا متموجة بعد حوالي 7 أيام. مخزن 3 × 10 6 خلايا في قارورة واحدة في النيتروجين السائل، ويشار إلى مرور 2.
- وضع الخلايا من قارورة واحدة في rollerbottle وإضافة GM. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. تنمو الخلايا متموجة تقريبا بعد 8 أيام. واحد rollerbottle يحتوي على حوالي 20-30 × 10 6 خلايا. خلايا الثقافة حتى مرور 6. لا تستخدم الخلايا من ممر أعلى من مرور 9، منذ النمط الظاهري الخلية قد تتغير. 2. هندسة الأنسجة من التركيبات المستندة إلى الليفين
- إعداد الغراء السيليكون عن طريق خلط المطاط الصناعي مع وكيل علاج (10:1). قطع 7 × 3 شرائح مستطيلة ملم من الفيلكرو. الغراء الفيلكرو إلى 6 لوحة الثقافة جيدا، مع أغشية مرنة لتشكيل الصليب، وترك مساحة مربعة من 3 ملم بين الشرائط الفيلكرو.
- يجف الغراء سيليكون بين عشية وضحاها في الفرن على 60 درجة مئوية لضمان تصلب الغراء. تعقيم وذلك بإضافة 70٪ ETOH إلى الآبار واحتضان لمدة 30 دقيقة. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني وإزالة كل برنامج تلفزيوني من أهلا وسهلاLS والفيلكرو. وضعت تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة والحفاظ على عقيمة حتى الاستخدام.
- إعداد الأنسجة المتوسطة الهندسة (TM)، ويتألف من جنرال موتورز و 130 ملغ من حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات.
- إضافة 1 ملغ / مل حمض الكابرويك ε الأمينية (ACA) إلى TM. يستخدم ACA ل7 ايام الاولى من ثقافة لمنع الليفين من 11 المهينة. بدلا من ذلك، أبروتينين يمكن استخدامها.
- لمنع تشكيل أجمة، تسمح الفيبرينوجين للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح. بدون كتل الفيبرينوجين سوف تذوب بسهولة أكبر. حل الفيبرينوجين إلى تركيز 10 ملغ الفعلية بروتين / مل TM 7 تستكمل مع ACA. تصفية العقيمة الحل الفيبرينوجين، قد تكون هناك حاجة إلى عدة مرشحات. تخزين على الجليد حتى الاستخدام.
- حل الثرومبين إلى تركيز من 10 وحدة دولية / مل TM 7 تستكمل مع ACA. تخزين على الجليد حتى الاستخدام. </ OL>
- يعرض للتريبسين الخلايا، في resuspend جنرال موتورز والعد.
- استخدام 15 × 10 6 خلية / مل لبذر يبني الأنسجة المستندة إلى الفيبرين (تركيز على أساس أساليب هندسة الأنسجة صمامات القلب 7). يتكون الجل واحد من 100 ميكرولتر GOF ش، وبالتالي من 1.5 × 10 6 خلايا. وضع 1.5 × 10 6 خلايا في أنبوب الطرد المركزي واحد، مما أدى إلى العديد من أنابيب الطرد المركزي وعدد من المواد الهلامية التي سيتم إجراؤها.
- الطرد المركزي الخلايا في 350 x ج لمدة 7 دقائق وتجاهل طاف. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر الثرومبين. إضافة 4 ميكرولتر من اللون الأزرق الفلورسنت البوليسترين المجهرية لهذا التعليق. وضع 50 ميكرولتر من الفيبرينوجين في قارورة. استخدام ماصة لتولي الثرومبين ميكرولتر 50 مع الخلايا. زيادة حجم ماصة إلى 100 ميكرولتر. ماصة الحل ميكرولتر 50 من الثرومبين معالخلايا في قارورة مع الفيبرينوجين لمزج الثرومبين والفيبرينوجين، وتناول خليط ميكرولتر 100.
- ماصة الخليط جل في وبين شرائط الفيلكرو. الوقت دبق نموذجي لالليفين المواد الهلامية، وبمجرد أن المكونات هي مختلطة، هو من أجل من 20 ثانية.
- احتضان الايقاف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء بنسبة 95٪ / 5٪ CO 2 الحاضنة للسماح دبق قبل أن يضيف ثقافة TM مع ACA.
- استبدال TM مع ACA كل 2-3 أيام لمدة 7 أيام الأولى. المواد الهلامية هي مستقرة بما فيه الكفاية بعد أسبوع واحد ليكون مثقف دون ACA. بعد الأسبوع الأول استبدال TM كل 2-3 أيام. إضافة 6 مل من TM لكل بئر. في يوم قد أنتجت خلايا الكولاجين 12 بما يكفي لتصور.
- يتم تطبيق الضغط ثابت من قبل خلايا مباشرة، وذلك بسبب الجر الخليوي والضغط 12. للحث على إعادة تنظيم الكولاجين، وقطع الأنسجة بناء فضفاضة من قطعتين الفيلكرو في اتجاه واحد. هذه النتائج في القيود أحادي الاتجاه (الشكل 1A). تنفيذ هذا في يوم 12، ومنذ ذلك الحين هو بناء ما يكفي مستقرة، وأودعت الكولاجين.
- تطبيق سلالة دوري عن طريق تطبيق فراغ إلى أسفل لوحات الثقافة مع أغشية مرنة، مع استخدام نظام FX4000T فليكسسيل. وضع لوحات على اللوح الأساس، وعلى رأس من المشاركات جار (والتي هي جزء من اله دوري جهاز التحميل). المضخة ينطبق فراغ على الغشاء، وبالتالي يسحب غشاء على آخر مستطيلة الكذب تحت. ويرجع ذلك إلى المرفقات على شكل صليب من النسيج يبني لغشاء (عبر الفيلكرو)، وآخر مستطيل سلالة دوري تطبيقه هو أحادي المحور (الشكل 1B).
- في البداية، استخدم ثقافة ثابت لمدة 5 أيام لتحقيق السلامة الميكانيكية الأولية، قبل تطبيق سلالة دوري بدءا من اليوم 6. برنامج بروتوكول صمة عار دوري في وحدة التحكم لمضخة فراغ. على سبيل المثال استخدام متقطعة بروتوكول سلالة دوري المحددة سابقا، مع اتجاه أحادي المحور 13. هذا يتكون من سلالة متقطعة من موجة جيبية مع 1 هرتز، يجهد من 0 إلى سلالة 5٪، لفترات تتراوح بين 3 ساعة، تناوبت مع 3 ساعة فترات الراحة. تنفيذ هذا البروتوكول سلالة دوري لمدة 7 أيام، الأمر الذي أدى منظمة الكولاجين الانحياز.
- عادة بعد 12 يوما أنتجت HVSCs على تنظيم أعمال الكولاجين الانحيازن. بعد التوصل إلى منظمة الكولاجين الانحياز، تغيير أحادي المحور دوري اتجاه الضغط، ليكون عمودي على اتجاه سلالة الأصلي. القيام بذلك عن طريق تحويل المشاركات مستطيلة بنسبة 90 درجة.
- لتصور نشطة، في الوقت الحقيقي إعادة عرض الكولاجين، وعينات التسمية مع تحقيقات التي لا تتداخل مع بقاء الخلية أو تشكيل الكولاجين. استخدام مجسات لصبغ fluorescently السيتوبلازم الخلية والكولاجين.
- الجيل الثاني التوافقي بدلا من ذلك باستخدام ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي يمكن استخدامها لتصور هياكل الكولاجين باستخدام تألق ذاتي 14، مع الإثارة في 780 نانومتر، وكشف بين 500-550 نانومتر.
- إزالة لوحات ثقافة من الإعداد والحاضنة، لعينات المتوترة دوريا خلال ساعة فترة راحة 3، ونقلهم إلى ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي لتصور الخلايا والكولاجين.
ملاحظات: استخدم فقط الجانب لينة من الفيلكرو ومواجهة هذا الجانب الصعودي. عندما الإلتصاق الفيلكرو، لا تغطي سوى الفيلكرو مع السيليكون الغراء، لا تنتشر في جميع أنحاء الغراء جيدا. منذ وحات ثقافة ديك قيعان غشاء السيليكون، واستخدام شيء تحت لوحة جيدا لتعزيز أغشية مرنة، لضمان سهولة الإلتصاق في لوحة.
ملاحظة: حل المزيج بلطف الفيبرينوجين إلى منع الكثير من تشكيل رغوة.
ملاحظة: هناك حاجة إلى تخزين على الجليد لمنع دبق في وقت مبكر من الثرومبين والفيبرينوجين.
ملاحظة: يتم استخدام الفلورسنت البوليسترين المجهرية كعلامات المرجعية الداخلية لتحليل الصور. عندما خلط الثرومبين والفيبرينوجين، ومنع تشكيل فقاعات الهواء من قبل pipetting بعناية الخليط. وسوف ينتج فقاعات الهواء في ثقوب في هلام الليفين.
ملاحظات: هل هذا في أسرع وقت ممكن لمنع دبق قبل pipetted الخليط في طبق بشكل جيد. ممارسة قبل استخدام الخلايا والخرز.
3. تطبيق التوتر وإحداث تغييرات في الانفعال والقيود
4. تصور الخلايا والكولاجين
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا النموذج يسمح للنظام زراعة المصنفة الأرومة الليفية العضلية المواد الهلامية الليفين. الشكل 1A يظهر الأنسجة مثقف الأول في ظل قيود ذو محورين ثابت. يتم الافراج القيود الأنسجة عن طريق قطع الجل الليفين من اثنين من القيود، إلى خلق قيود ثابت ذو محورين، وضغط الأنسجة ويعيد تشكيل بعد ذلك (الشكل 1A). لسلالة دوري، يتم تربيتها الأنسجة تحت قيود ذو محورين ثابت كذلك. بعد 5 أيام سلالة أحادي المحور دوري يمكن تطبيقها (1B الشكل). للحث على إعادة توجيه الكولاجين، واتجاه الضغط أحادي المحور يمكن تغيير لاتجاه عمودي (1B الشكل). المجهرية المصنف مع الخليط هلام، عرض نمط عشوائي، والذي يستخدم في الانتقال مواقع محددة مسبقا للالوقت الفاصل بين التصوير (الشكل 2). أرقام 2A و 2C تظهر صورة من الخلايا، والكولاجين والخرز. نفس هذه الصور يتم مسحها 3 أيام (الارقام ..ه 2B) و 2 أيام (الشكل 2D) في وقت لاحق، على التوالي. الخلايا وأنماط الكولاجين قد تغيرت، ولكنها تستخدم أنماط حبة للانتقال الخلايا والكولاجين. عينات زراعة لمدة 12 يوما النتائج في إنتاج الكولاجين الذاتية بكميات كافية لتكون تصور مع المجهري متحد البؤر (الشكلان 3 و 4). باستخدام نتائج ثقافة ثابت أو دوري في منظمة الكولاجين تختلف اختلافا واضحا، حيث ثقافة ثابت ذو محورين يثير منظمة الكولاجين العشوائي (الشكل 3A) وسلالة دوري أحادي المحور تطبيقها على نتائج الأنسجة مقيدة ثنائية المحور في بنية الكولاجين الانحياز (أرقام 4A و B) . ويمكن دراسة هذه المنظمة الكولاجين مع مرور الوقت، في حين أن تغيير القيود ثابتة أو تغيير اتجاه سلالة دوري. عندما يتم تغيير القيود ثابت من ذو محورين لذو محورين، والتغيرات التوجه الكولاجين من التوجه العشوائي (الشكل 3A) إلى التوجه الانحياز (الشكل 3B). سلالة دوري يؤدي الى تغيير التوجه في سطح الأنسجة (أرقام 4A و C)، ولكن بعد 3 أيام، ويلاحظ أي تغير في جوهر الأنسجة (أرقام 4B و D).
الشكل 1. يبني المثقف في ظل قيود ذو محورين، وتستخدم لإعادة تنظيم الكولاجين بنسبة (A) الإفراج عن قيود ثابتة في اتجاه واحد، أو عن طريق (B) تغيير اتجاه سلالة دوري. يشار المشاركات التي كتبها جار خطوط سوداء منقطة. أشرطة النطاق تشير إلى 3 مم.
الشكل 2. مثال نموذجي للاستخدام أنماط حبة في الانتقال مواقع محددة مسبقا في 3D، في هذه الحالة في ثابتوتظهر عينات مثقف. خلايا باللون الأحمر، والكولاجين باللون الأخضر والخرز باللون الأزرق. A و C تظهر صورة من الخلايا، والكولاجين والخرز. يتم فحص هذه الصور 3 أيام (ب) و 2 أيام (D) في وقت لاحق، على التوالي. وتستخدم أنماط حبة للانتقال الخلايا والكولاجين. يشير شريط مقياس 50 ميكرون.
الشكل (3). R الصور في شرحه من 12 يوم سلالة ثابتة مع القيود ذو محورين (A) وإعادة توجيهها نظرا لضيق ذو محورين غضون 7 أيام (B) إلى بار. مقياس 50 ميكرون.
الشكل 4. صور الممثل بعد 12 أيام (5 أيام ساكنة، تليها 7 أيام السلالة دوري) لسلالة دوري على السطح (A) و~ 60 ميكرون في الأنسجة (B). بعد التغيير في اتجاه سلالة دوري (بعد 12 يوما)، في الخلايا السطحية والكولاجين إعادة توجيه (C)، ولكن ينظر إلى أي تغييرات في جوهر الأنسجة (D) بعد 3 أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام النموذج الموصوف من بنيات الليفين خلية بالسكان لديها امكانات كبيرة لدراسة الخلايا والكولاجين (RE) منظمة (دي جونغ وآخرون. 15)، على سبيل المثال لاستخدامها لأغراض هندسة الأنسجة. باستخدام الليفين باعتبارها الناقل الخلية الأولي، بعد تدهور الليفين، يتم إنشاء الأنسجة مع الخلايا والمصفوفة الذاتية فقط. في هذه الطريقة، يتم تحفيز الخلايا للرد على السلالة، إما ثابت أو دوري في الطبيعة، من خلال تطبيق القوات مقلص 16،17، الاستشعار عن حدود صلابة 12، أو عرض تجنب التوتر.
أهمية: وقد استخدمت بنيات الليفين قبل لدراسة الكولاجين (RE) تنظيم 18، ولكن ليس لديهم القدرة على تطبيق سلالة دوري و / أو دراسة بنيات بطريقة الوقت الفاصل، وكلاهما ممكن في هذه الطريقة المعروضة. وقد تم استخدام شرائط الفيلكرو التي توفر القيود في هذا النظام النموذجي قبل 19،لكن الجمع بين هذه التقنية مع لوحات ثقافة مع أغشية مرنة تسمح لتطبيق إجهاد دوري لفترات طويلة من الزمن. زراعة في هذه اللوحات يسمح لسهولة إضافة وإزالة المتوسطة والتصور من بنيات في حين لا تزال تعلق ومعقمة. وهذا يتيح دراسة العمليات ذات الصلة إعادة عرض-ساقطا الوقت أو حتى في الوقت الحقيقي.
التعديلات والتطبيقات المستقبلية: التطبيقات المستقبلية لنظام يمكن العثور عليها في التلاعب في عملية إعادة عرض 3D، على سبيل المثال عن طريق إضافة metalloproteinases أو العوامل التي تتداخل مع إنتغرين الجمعية أو إشارات. بجانب تطبيق مواد مضافة، مكونات نظام نموذجي يمكن تعديلها بسهولة عند دراسة الخلايا والكولاجين (RE) منظمة. يمكن تكييفها مصادر مختلفة الخلية، الخلايا السليمة والمريضة، ونضج من المصفوفة الكولاجين (على سبيل المثال عن طريق تنويع وقت للثقافة)، وشكل وحجم بناء على احتياجات محددة. النظام هو ق جيداuited عن مصادر الخلايا الأخرى، بدلا من HVSCs المستخدمة حاليا. ونحن قد استخدمت بالفعل هذا النظام لثقافة البطانية الخلايا تشكيل مستعمرة (ECFCs؛ PlosOne، مقبول للنشر)، حيث نلاحظ أن ECFCs توجيه الكولاجين التي أنتجت بشكل مختلف على سلالة من دوري HVSCs.
القيود المفروضة على تقنية: وجود قيود على نظام النموذج الحالي هو حجم كبير نسبيا من الأنسجة، والتي تتطلب 1.5 × 10 6 خلايا في بناء عند استخدام كثافة الخلية من 15 × 10 6 خلية / مل. هذا قد يشكل مشكلة في الحالات التي سيتم فيها استخدام مصادر الخلية أقل المتاحة. قيد آخر هو سمك الحالية للبنيات (حوالي 1 ملم)، والذي يرجع إلى (سميك) المرفقات الفيلكرو. وهذا يحد من مسح متحد البؤر لجزء فقط من العينة بأكملها. فمن الممكن أن تصل إلى عمق 200 ميكرون كحد أقصى في الأنسجة، وهو ما يكفي لتصور الاستجابات الخلوية داخل نواة للأنسجة الحالي، ولكن لاوفاق لا يؤدي إلى نظرة عامة سمك كامل.
الحرجة الخطوات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها: كما يقوم النظام النموذجي بشأن تشكيل الأنسجة بين نقاط التعلق الفيلكرو، وهذا يشمل أيضا الخطوات الحاسمة في البروتوكول. قطع ولصق الصحيح أمر ضروري وينبغي إيلاء اهتمام خاص لpipetting لدقيق للخليط جل في شرائط الفيلكرو لمرفق السليم للأنسجة، وهو أمر حاسم لتطبيق إجهاد دوري. ويمكن الاطلاع على خطوات حاسمة أخرى في اختيار مصدر الخلية والمواد المضافة المتوسطة. وستكون هناك حاجة الأمثل عندما زراعة مع مصدر مختلفة من الخلايا. حاليا، يتم استزراع يبني مع ACA لمدة 7 أيام، لوقف الليفين من الحاطة بالكرامة. مصدر مختلفة من الخلايا قد يؤدي أيضا إلى فترة زمنية مختلفة فيما يتعلق بكل من تشكيل الكولاجين وتدهور الليفين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد أجريت هذه الدراسة في برنامج البحوث من المواد الطبية الحيوية (BMM) معهد. وcofunded BMM من قبل وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية والزراعة والابتكار. ومن المسلم به بامتنان المساهمة المالية من Hartstichting NEDERLANDSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents. Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).
- Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling. Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).
- Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).
- Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).
- Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions. Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).
- Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).
- Schnell, A. M., et al. Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).
- Mol, A., et al. Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application. Circulation. , I152-I158 (2006).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).
- John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels. Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).
- Rubbens, M. P., et al. Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue. Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).
- Chen, W. L., et al. Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).
- de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs. Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).
- Merryman, W. D., et al. Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis. Am. J. Physiol. 290, (2006).
- Ingber, D. E. From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009. Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).
- Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).
- van der Schaft, D. W., et al. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267 (2013).
