Устранение одну клетку от Восемь клеток эмбрионов из амфипод ракообразных<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

Амфипода Parhyale hawaiensis является перспективным модельным организмом для изучения ракообразных эмбриологии и сравнительной развития членистоногих и эволюции. Этот протокол описывает способ ручного удаления отдельных бластомеров из ранних эмбрионов на стадии дробления из Parhyale.

Abstract

Амфипода Parhyale hawaiensis небольшой рачок найдено в приливных морских мест обитания по всему миру. За последние десять лет, Parhyale стала перспективный модельный организм для лабораторных исследований развития, обеспечивая полезное сравнение аутгруппе к хорошо изученной членистоногих модельного организма дрозофилы. В отличие от синцитиальных расколов дрозофилы, ранние расколы из Parhyale являются holoblastic. Отображение Судьба использованием индикаторных красителей внедрен в начале бластомеров показали, что все три зародышевых листка и зародышевой линии устанавливаются на стадии восьми клеток. На данном этапе, три бластомеры суждено привести к эктодермы, три суждено привести к мезодермы, а остальные две бластомеры являются предшественниками в энтодермы и зародышевой линии соответственно. Тем не менее, бластомера эксперименты абляции показали, что эмбрионы Parhyale также обладают значительной нормативной capabilitiэс, например, что судьбы бластомеров удалена на стадии восьми клеток может быть передана потомкам некоторые из оставшихся бластомеров. Бластомер абляция была описана ранее одним из двух способов: инъекции и последующей активации фототоксических красителей или ручного удаления. Тем не менее, фотоабляцию убивает бластомеры но не удаляет мертвое тело клеток из эмбриона. Поэтому Полное физическое удаление конкретных бластомеров может быть предпочтительным методом абляции для некоторых приложений. Здесь мы приводим протокол для ручного удаления отдельных бластомеров от стадии восьми клеток эмбрионов Parhyale, иллюстрирующие инструменты и ручные процедуры, необходимые для полного удаления тела клетки, сохраняя при этом оставшиеся бластомеры жив и нетронутыми. Этот протокол может быть применен к любой клетке Parhyale на стадии восьми клеток, или к бластомеров других этапах рано спайности. Кроме того, в принципе этот протокол может быть применимо к ранней CleaВаге этап эмбрионы других holoblastically расщепляющих морских беспозвоночных.

Introduction

Амфипода ракообразное Parhyale hawaiensis которая сформировалась в течение последнего десятилетия в качестве перспективного модельного организма с большим потенциалом для использования в эволюционной биологии развития исследований ^1. Среди членистоногих, большинство модельных систем являются насекомые, и наиболее изученным из них является плодовой мухи дрозофилы D.. MELANOGASTER является членом отряда насекомых двукрылых, и как такие дисплеи многих эмбриологических особенностей, которые являются производными по отношению к тем из базально ветвящихся насекомых ^2. Кроме того, насекомые вложены в Подтип Pancrustacea ^3, а это означает, что насекомые имеют своих ближайших родственников в давней «естественной» группы под названием pancrustaceans, и что эта группа парафилетическими. Это говорит о том, что в дополнение к базально ветвления модели насекомых, исследования других ракообразных обязаны получить более широкий взгляд на эволюционной истории черт развитияй молекулярные механизмы, которые были так хорошо изучены в D. MELANOGASTER. Однако, очень немногие ракообразные были хорошо известны для экспериментального лабораторного анализа развития. Амфипода П. hawaiensis является весьма сговорчивым лабораторная модель системы, поддаются диапазоне экспериментальных методик. Амфиподы отображения много уникальных особенностей в их родительской надотряда Peracarida (пляж бункеры, бокоплавы и креветки а), и, следовательно, считается, относительно полученных в рамках этой группы ракообразных. Тем не менее, относительная легкость эмбрионального и функциональной генетической манипуляции, предлагаемых Parhyale сделать это амфипода ценным дополнением к текущей инвентаризации модельных организмов.

В лабораторных животных, P. hawaiensis дает много преимуществ. Животные толерантны в широком диапазоне температур и солености, а также хорошо выживают в больших культур искусственной морской воде ^1. Легко отличить межосевомEEN мужчины и женщины, основанные на четких морфологических различий, в первую очередь, крупных, крючковатый, передних магистральных придатков, что мужчины используют, чтобы понять самок во время спаривания. Для эмбрионального и развития работы, П. hawaiensis имеет несколько очень привлекательных черт. Эмбриогенеза длится примерно 10 дней, а время до половой зрелости примерно через шесть недель на 28 º C (но учтите, что Parhyale хорошо выживает при температуре от примерно 20-30 ° С, и что подробная развития информация постановка доступен для эмбрионов, поднятых на 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, и 26 º C ^5,6). Взрослые спариваться круглый год в лаборатории, так эмбрионы доступны в любое время года. Самки откладывают 2-20 (в зависимости от возраста женщины) оплодотворенных яиц в брюшной выводковой сумке, расположенной между первым нескольких пар ног (1А и 1В), а можно собрать эти эмбрионы очень ранней стадии развития, не убивая самку или повреждения эмбрионов (рис. 1в). Эмбрионы выжить в фильтрованной искусственной морской воде до вылупления, могут быть зафиксированы для последующего экспрессии генов или гистологического анализа ^7, и подробное промежуточная таблица позволяет точно идентифицировать прогресс через развитие ^5. Прочные протоколы были использованы для выполнения анализа экспрессии генов путем в гибридизация ^8-15 или иммунного окрашивания ^4,16,17, функциональный нокдаун РНК-интерференции ^13,15 или ^12, Morpholinos и стабильной зародышевой линии трансгенеза ^18. Использование трансгенеза систему, индуцируемой экспрессии ¹⁴ и энхансерной ловушку ¹⁹ методы также могут быть использованы для изучения функции генов в P. hawaiensis. В то время как в открытом доступе последовательность генома в настоящее время недоступен, транскриптома содержащие стенограммы производится во время оогенеза и эмбриогенеза пчелн заново собран и аннотированный ^20, и хранение в базе данных для поиска ^21, облегчая обнаружение генов. В общем, P. hawaiensis является весьма сговорчивым модель организма подходит для нескольких экспериментальных и генетических подходов к пониманию развития.

В отличие от ранних синцитиальных сколах D. MELANOGASTER, П. эмбрионы hawaiensis расщеплять holoblastically следующие оплодотворение (рис. 2а). Анализ трассировки Lineage показал, что по третьему расщепления, каждый из бластомеров третьей расщепления специально суждено привести к одному из трех зародышевых листков или зародышевой линии ⁶ (фиг. 2В). Эти данные вместе с микрочипов данных ^22, клеточной линии анализирует ^6,23 и изоляции бластомеров эксперименты ⁴ предположили, что потенциалы развития сегрегированны по меньшей мере некоторым третьим бластомеров расщеплению асимметричного наследования челл судьба детерминанты. Соответственно, в бластомеров абляции экспериментов, в которых зародышевой линии предшественник (называется "г" в Parhyale клеточных клонов номенклатуре ⁶⁾ удаляли на этапе восемь клеток, эмбрионы не было половых клеток на более поздних стадиях развития ^4, как показано отсутствие клеток выражая белка Vasa, который является маркером зародышевой линии в большинстве многоклеточных ^24. В противоположность этому, соматические бластомера эксперименты абляции показал, что П. эмбрионы hawaiensis также обладают значительными нормативные возможности, такие, что судьбы мезодермы или эктодермы бластомеров предшественников удалена на стадии восьми клеток может быть передана потомкам некоторые из оставшихся бластомеров ^25. Как регулятивный замена судьба клетки может произойти, и степень автономного принятия клеточных судеб соматическими бластомеров, остается неизвестным. Экспериментальные эмбриологические методы, такие как бластомеров абляции может быть полезно в understanдинь относительная автономия и nonautonomy из клеточных судеб решений ^26,27 и поэтому интерес к изучению P. hawaiensis эмбриогенеза.

В экспериментах, которые продемонстрировали регулятивный замену эктодермальных и мезодермальных линий, бластомер абляция была выполнена в виде инъекций ²⁸ и последующего возбуждения фототоксических красителей ^25. Хотя этот метод является эффективным средством уничтожения введенного бластомера (ы), он не полностью удалить труп клеток из эмбриона. Кроме того, различия наблюдались между данными клеточной линии, собранных до гаструляции стадиях эмбриогенеза путем введения бластомеров с люминесцентными клона индикаторов ^28,29 и данных, собранных следуя невозмущенные бластомеры через развитие тех же эмбриональных стадиях ^23. Поэтому Полное физическое удаление конкретных бластомеров может быть предпочтительным методом абляции для некоторых приложений.

Мы ранее были опубликованы результаты клеточной линии анализирует эмбрионов, в которых отдельные клетки вручную удалена ^23. Тем не менее, тонкие операции, необходимые для удаления отдельных бластомеров от ранней стадии эмбрионов расщепления до сих пор не полностью описаны. Здесь мы приводим протокол для сбора P. эмбрионы hawaiensis и руководство абляция одной бластомера от стадии эмбриона восьми клеток. Цель этого метода состоит в достижении полного удаления тела клетки от эмбриона, что позволяет наблюдать сотовых поведения и клеточных судеб компетенции остальных клеток во время эмбриогенеза и постэмбрионального развития. Наш протокол показывает удаление зародышевой линии предшественника г (рис. 2в), но могут быть применены к любой клетке на стадии восьми клеток, или к бластомеры ранних стадиях дробления. В принципе, этот протокол может применяться для удаления отдельных клеток из ранних эмбрионов на стадии дробления на флористикуг holoblastically расщепления морских беспозвоночных.

Protocol

Комментарии, которые могут быть полезными при выполнении определенные шаги выделены курсивом. 1. День 1: Получение материалов Подготовьте следующие материалы (см. таблицу материалов и оборудования): 15 см и 22 см Пипетки Пастера Алмазный писец фильтруют иску…

Representative Results

После успешной абляции один третий расщепления P. hawaiensis микромеры как описано в данном протоколе, остальные микромеры постепенно перенести свои позиции немного для того, чтобы частично занимают пространство ранее занимаемую абляцированную бластомера. Например, когда г ?…

Discussion

Мы опишем протокол для ручного абляции и полного физического удаления отдельных бластомеров из ранних стадиях расщепление амфипод P. hawaiensis. Мы демонстрируем использование этого протокола путем удаления одного зародышевой линии клеток предшественник г от стадии эмбрион…

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems