Ablatie van een enkele cel van acht-cel embryo's van Amphipod Crustacean<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

De amphipod Parhyale hawaiensis is een veelbelovend model organisme voor studies van schaaldieren embryologie en vergelijkende geleedpotigen ontwikkeling en evolutie. Dit protocol beschrijft een methode voor het handmatig verwijderen van enkele blastomeren van vroeg decollete stadium embryo's van Parhyale.

Abstract

De amphipod Parhyale hawaiensis is een klein schaaldier gevonden in intertidale mariene habitats wereldwijd. In het afgelopen decennium, heeft Parhyale ontpopt als een veelbelovende modelorganisme voor laboratoriumonderzoek van ontwikkeling, een nuttig outgroup vergelijking met de goed bestudeerd geleedpotige modelorganisme Drosophila melanogaster. In tegenstelling tot de syncytieel splitsingen van Drosophila, de vroege breuklijnen van Parhyale zijn holoblastic. Lot in kaart brengen met behulp van tracer kleurstof ingespoten in de vroege blastomeres hebben aangetoond dat alle drie de kiem lagen en de kiembaan worden vastgesteld door de acht-cellig stadium. In dit stadium zijn drie blastomeren gedoemd aanleiding geeft tot het ectoderm, drie gedoemd aanleiding geeft tot het mesoderm, en de resterende twee blastomeren zijn de voorlopers van het endoderm en kiemlijn respectievelijk. Echter, blastomere ablatie experimenten aangetoond dat Parhyale embryo belangrijke regulerende capabiliti bezitten ookes, zodanig dat het lot van blastomeren geablateerd bij de acht-cellig stadium kan worden overgenomen door de nakomelingen van enkele van de resterende blastomeren. Blastomeer ablatie is eerder beschreven door een van twee methoden: injectie en daaropvolgende activatie van fototoxische kleurstoffen of handmatige ablatie. Echter, fotoablatie doodt blastomeren, maar niet de dode cel lichaam te verwijderen van het embryo. Volledige fysische verwijdering van specifieke blastomeren kan daarom een ​​voorkeurswerkwijze ablatie voor sommige toepassingen. Hier presenteren we een protocol voor handmatig verwijderen van enkele blastomeren van de acht-cellig stadium van embryo Parhyale illustreren de instrumenten en handmatige procedures voor volledige verwijdering van het cellichaam terwijl de resterende blastomeren levend en intact. Dit protocol kan worden toegepast op elk Parhyale cel acht-cellig stadium, of blastomeren andere vroege stadia splitsing. Bovendien, in beginsel dit protocol voor vroege reini kanvage stadium embryo's van andere holoblastically klieven ongewervelde zeedieren.

Introduction

De amphipod schaaldier Parhyale hawaiensis heeft in het afgelopen decennium ontpopt als een veelbelovende modelorganisme met een groot potentieel voor gebruik in de evolutionaire ontwikkelingsbiologie onderzoek ^1. Onder de geleedpotigen, meest modelsystemen insecten en de meest uitgebreid bestudeerde van deze is de fruitvlieg Drosophila melanogaster. D. melanogaster is een lid van de insectenorde Diptera, en als zodanig laat verschillende embryologische functies die zijn afgeleid met betrekking tot die van basaal vertakking insecten ^2. Bovendien zijn insecten genest binnen de subphylum Pancrustacea ^3, betekent dat insecten hun naaste verwanten in de "natuurlijke" group langdurige genoemd pancrustaceans en dat deze groep paraphyletic. Dit suggereert dat naast basaal vertakking insecten modellen, zijn studies van andere schaaldieren vereist om een ​​breder zicht op de evolutionaire geschiedenis van de ontwikkelingskarakteristieken krijgen eennd moleculaire mechanismen die zijn zo goed bestudeerd in D. melanogaster. Maar heel weinig schaaldieren zijn goed ingeburgerd voor experimentele laboratoriumanalyse van ontwikkeling. De amphipod P. hawaiensis is een zeer handelbaar laboratoriummodel systeem vatbaar voor een aantal experimentele technieken. Amphipoden weer vele unieke eigenschappen binnen hun ouder superorder Peracarida (strand hoppers, Scuds, en goed garnalen), en worden daarom gedacht dat relatief afgeleid worden binnen deze groep van kreeftachtigen. Toch is de relatieve gemak van embryologische en functionele genetische manipulatie aangeboden door Parhyale maken dit amphipod een waardevolle aanvulling op de huidige inventaris van modelorganismen.

Als een proefdier, P. hawaiensis biedt vele voordelen. Dieren zijn tolerant voor een breed scala aan temperaturen en zoutgehaltes, en te overleven goed in de grote culturen van kunstmatig zeewater ^1. Het is gemakkelijk om tuss onderscheidenEEN mannen en vrouwen op basis van duidelijke morfologische verschillen, met name, de grote, verslaafd, voorste romp appendages die mannetjes gebruiken om de vrouwtjes te grijpen tijdens de paring. Voor embryologische en ontwikkelingswerk, P. hawaiensis heeft een aantal zeer aantrekkelijke eigenschappen. Embryogenese duurt ongeveer 10 dagen en de tijd om geslachtsrijp is ongeveer zes weken bij 28 º C (maar let op dat Parhyale overleeft goed bij temperaturen van ongeveer 20-30 º C, en dat nadere ontwikkelingsstoornissen enscenering informatie is beschikbaar voor embryo verhoogd bij 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, en 26 º C ^5,6). Volwassenen paren het hele jaar door in het laboratorium, zodat de embryo's zijn beschikbaar op elk moment van het jaar. Vrouwtjes 2-20 (afhankelijk van de leeftijd van de vrouw) bevruchte eieren in een ventrale broedbuidel gelegen tussen de eerste verscheidene paren benen (Figuren 1A en 1B), en het is mogelijk deze embryo verzamelens zeer vroeg in de ontwikkeling zonder het doden van de vrouw of beschadiging van de embryo's (figuur 1C). De embryo's overleven in gefilterd kunstmatig zeewater tot aan het uitkomen, voor daaropvolgende genexpressie of histologische analyse ⁷ kan worden vastgesteld, en een gedetailleerde stagingtabel maakt nauwkeurige identificatie van de vooruitgang door ontwikkeling ^5. Robuuste protocollen zijn gebruikt om genexpressie analyse uit te voeren door in situ hybridisatie ^8-15 of immunokleuring ^4,16,17, functionele knockdown door RNA interferentie ^13,15 of morfolino ¹² en stabiele kiemlijn transgenese ^18. De transgenese systeem, induceerbare expressie ¹⁴ en enhancer trap ¹⁹ werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om genfunctie in P. onderzoeken hawaiensis. Terwijl een openbaar genoomopeenvolging is momenteel niet beschikbaar, een transcriptome met transcripten geproduceerd tijdens oögenese en embryogenese heeft been de novo geassembleerd en geannoteerd ^20, en gedeponeerd in een doorzoekbare database ^21, faciliteren genontdekking. Kortom, blz. hawaiensis is een zeer soepel model organisme geschikt voor meerdere experimentele en genetische benaderingen voor het begrip ontwikkeling.

In tegenstelling tot de eerste syncytieel splitsingen D. melanogaster, P. hawaiensis embryo's kleven holoblastically na de bevruchting (Figuur 2A). Lineage tracing analyse heeft aangetoond dat door het derde splitsing, elk van de derde splitsing blastomeren is speciaal voorbestemd aanleiding geeft tot een van de drie kiemlagen of germinale ⁶ (figuur 2B). Deze gegevens, samen met de microarray data ^22, cellijn analyseert ^6,23 en blastomere isolatie experimenten ⁴ hebben gesuggereerd dat ontwikkelings mogelijkheden zijn gescheiden op zijn minst enige derde splitsing blastomeres door asymmetrische erfenis van cell lot determinanten. Dienovereenkomstig, in blastomeer ablatie experimenten waarin de kiembaan precursor (aangeduid met "g" in de Parhyale cellijn nomenclatuur ⁶⁾ werd onder de acht cel stadium embryo ontbrak kiemcellen in latere ontwikkelingsstadia ^4, zoals aangegeven door de afwezigheid van cellen uiting van de eiwit Vasa, dat is een kiem lijn marker in de meeste metazoa ^24. Daarentegen somatische blastomeer ablatie experimenten toonden aan dat P. hawaiensis embryo's bezitten ook belangrijke regulerende functies, zodanig dat het lot van mesoderm of ectoderm voorloper blastomeren weggenomen bij de acht-cel stadium kunnen worden overgenomen door de afstammelingen van enkele van de resterende blastomeren ^25. Hoe regulatieve lot van de cel vervanging kan optreden, en de mate van autonome cellot goedkeuring door somatische blastomeren, blijft onbekend. Experimentele embryologische technieken zoals blastomere ablatie kan nuttig zijn in Understanding van de relatieve autonomie en nonautonomy cel beslissingen over het lot ^26,27 en zijn daarom van belang bij de studie van P. hawaiensis embryogenese.

In de experimenten die regulatieve vervanging van ectodermale en mesodermaal geslachten aangetoond, werd blastomere ablatie uitgevoerd door injectie ²⁸ en daaropvolgende excitatie van fototoxische kleurstoffen ^25. Hoewel deze techniek is effectief bij het doden van de geïnjecteerde blastomeer (pen) niet volledig dode cellichaam uit het embryo. Bovendien zijn verschillen waargenomen tussen cellijn gegevens die tot gastrulatie stadia van embryogenese door injectie blastomeren met fluorescerende tracers lijn ^28,29 en gegevens verzameld door volgende onverstoord blastomeren door de ontwikkeling van dezelfde embryonale stadia ^23. Volledige fysische verwijdering van specifieke blastomeren kan daarom een ​​voorkeurswerkwijze ablatie voor sommige toepassingen.

We hebben eerder de resultaten van cellijn gepubliceerde analyses van embryo's waarin de afzonderlijke cellen handmatig werden weggenomen ^23. Echter, de delicate handelingen die nodig zijn om enkele blastomeren van vroeg decollete stadium verwijderen van embryo's nog niet volledig beschreven. Hier presenteren we een protocol voor de verzameling van P. hawaiensis embryo's en handmatige ablatie van een blastomeer uit een acht-cellig stadium embryo. Het doel van deze methode is om volledige verwijdering van het cellichaam van het embryo bereiken, waardoor waarneming van de cellulaire gedrag en cellot bevoegdheden van de resterende cellen gedurende embryogenese en post-embryonale ontwikkeling. Het protocol duidelijk verwijdering van de kiembaan precursor g (figuur 2C), maar kan worden toegepast op een cel acht-cellig stadium, of blastomeren van eerdere klieving fasen. In principe zou dit protocol worden toegepast op enkele cellen van de vroege splitsing stadium embryo's van Othe verwijderenr holoblastically klieven ongewervelde zeedieren.

Protocol

Reacties die nuttig kan zijn in het uitvoeren van bepaalde stappen zijn cursief weergegeven. 1. Dag 1: Voorbereiding van Materialen Bereid de volgende materialen (zie tabel van materialen en apparatuur): 15 cm en 22 cm pasteurpipetten Diamond schrijver gefiltreerd kunstmatig zeewater (zoutgehalte tussen ,0018-,0020) bevattende 1 mg / ml amfotericine B (1:100 van 100 mg / ml voorraadoplossing), 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (01:50 van e…

Representative Results

Na succesvolle ablatie van enkele derde splitsing P. hawaiensis micromeres zoals beschreven in dit protocol, geleidelijk de resterende micromeres verschuiven hun positie lichtjes zodat de ruimte vroeger bezet door de geablateerde blastomere gedeeltelijk bezetten. Bijvoorbeeld, wanneer g wordt verwijderd, de naburige blastomeren mr en ml enigszins verschuiven en kom naar de laterale randen van cellen die vroeger in direct contact met g (vergelij…

Discussion

We beschrijven een protocol voor handmatige ablatie en volledige fysieke verwijdering van enkele blastomeren van de vroege stadia van de splitsing amphipod P. hawaiensis. We demonstreren het gebruik van dit protocol door het verwijderen van de enkele kiembaan voorloper cel g van een acht-cellig stadium embryo, en laten zien dat ablatie succesvol door te bevestigen ontbreken van g 's dochter cellen in latere embryogenese is geweest. Dit protocol kan worden gebruikt om elk va…

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems