Amphipod 갑각류의 여덟 세포 배아에서 단일 셀의 절제<em> Parhyale hawaiensis</em
Summary
amphipod Parhyale의 hawaiensis 갑각류 발생학 및 비교 절지 동물의 개발과 진화 연구를위한 유망한 모델 생물이다. 이 프로토콜은 Parhyale의 초기 분열 단계의 배아에서 단일 할구를 수동으로 제거하는 방법을 설명합니다.
Abstract
amphipod Parhyale의 hawaiensis 전세계 조간대 해양 서식지에서 발견되는 작은 갑각류이다. 지난 10 년간 Parhyale은 잘 공부 절지 동물 모델 생물 초파리 melanogaster의에 유용한 외집단 비교를 제공하고, 개발의 실험실 연구를위한 유망한 모델 생물로 떠오르고있다. 초파리의 포체 분열 달리 Parhyale의 초기 분열은 holoblastic이다. 초기 할구에 주입 추적 염료를 사용 운명 매핑은 세 가지 배엽 및 세균 라인이 여덟 세포 단계에 의해 설립되는 것으로 나타났습니다. 이 단계에서, 세 할구는 외배엽으로 야기 운명 아르 세는 중배엽으로 야기 운명, 나머지 두 개의 할구 각각 내배엽 및 세균 계 전구체되어있다. 그러나 할구 제거 실험은 Parhyale 배아는 상당한 규제 capabiliti을 가지고있는 것으로 나타났습니다여덟 세포 단계에서 절제 할구의 운명 나머지 할구의 일부의 자손에 의해 점령 할 수 말이지, 그런 것을. 주입 및 광독성 염료 또는 수동 제거 0098 : 할구 절제는 이전에 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 설명하고있다. 그러나 photoablation은 할구를 죽이고 있지만 배아에서 죽은 세포의 시체를 제거하지 않습니다. 특정 할구의 완전한 물리적 제거 따라서 일부 응용 프로그램 제거하는 바람직한 방법이 될 수 있습니다. 여기에 우리가 살아 그대로 남아있는 할구를 유지하면서 신체의 세포의 완전한 제거에 필요한 악기 및 수동 절차를 설명, Parhyale 배아의 8 세포 단계에서 하나의 할구를 수동으로 제거 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 팔 세포 단계에서, 또는 다른 초기 분열 단계의 할구 어떤 Parhyale 셀에 적용될 수있다. 또한, 원칙적으로이 프로토콜은 초기 클레아에 적용 할 수있다다른 holoblastically 쪼개기 해양 무척추 동물의 vage 단계의 배아.
Introduction
amphipod 갑각류 Parhyale의 hawaiensis 진화 발달 생물학 연구 1에서 사용하기에 큰 잠재력을 가진 유망한 모델 생물로 지난 십 년간 떠오르고있다. 과일. D.에게 초파리 비행하는 절지 동물 중에서 가장 모델 시스템은 곤충, 그리고 가장 광범위하게 이들의 연구 의 melanogaster은 곤충 순서 Diptera의 멤버이며, basally 분기 곤충 2와 관련하여 파생 된 이러한 표시 많은 발생 학적으로 특징. 또한, 곤충 곤충 pancrustaceans라는 오랜 "자연"그룹 내에서 자신의 가장 가까운 친척이 있다는 것을 의미 아문 Pancrustacea 3 중첩하고,이 그룹 paraphyletic입니다됩니다. 이 외에도 basally 곤충 모델을 분기 할 것을 제안, 다른 갑각류의 연구 개발 특성의 진화 역사의 넓은 시각을 얻기 위해 필요합니다잘 D.에서 공부 한 차 분자 메커니즘 의 melanogaster. 그러나, 거의 갑각류 잘 개발의 실험적인 실험실 분석을 위해 설립되었다. amphipod P. hawaiensis 실험 기술의 범위에 순종 매우 다루기 쉬운 실험 모델 시스템이다. 갑각류는 상위 superorder Peracarida (비치 호퍼, 스커드, 잘 새우) 내에서의 다양하고 독특한 기능을 표시하고, 따라서 상대적으로 갑각류의이 그룹 내에서 파생 된 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, Parhyale에서 제공 학적 및 기능적 유전자 조작의 상대적 용이성이 amphipod 모델 생물의 현재 재고에 귀중한 추가합니다.
실험실 동물, P.로 hawaiensis는 많은 장점을 제공합니다. 동물은 온도와 염분의 광범위한 관용, 인공 해수 1의 큰 문화에 잘 남아있다. 그것은 betw 구별하기 쉬운명확한 형태 학적 차이, 짝짓기하는 동안 암컷을 파악하는 데 사용하는 수컷 특히, 대형, 후크, 전방 트렁크 부속에 따라 EEN의 남성과 여성. 배아 발달 작업, P. hawaiensis 몇 가지 매우 매력적인 기능을 가지고 있습니다. 배아는 대략 10 일을 지속하고 성적 성숙에 시간이 28 º C에서 약 6 주입니다 (하지만 Parhyale 약 20 ~ 30 º의 C에 이르는 온도에서 잘 살아 있습니다, 그 상세한 개발 준비 정보는 18 º C 4에서 제기 배아 사용할 수 있습니다 25 º C에서 4, 26 º C 5,6). 성인은 실험실에서 일년 내내 짝짓기, 그래서 배아는 일년 중 언제든지 가능합니다. 여성은 처음 몇 다리 쌍 (그림 1A와 1B)간에있는 복부 알주머니로 수정란 (여성의 나이)에 따라 2-20을 마련하고, 이들 배아를 수집 할 수 있습니다여성을 살해하거나 배아 (그림 1C)을 손상시키지 않고 초기 개발이야. 배아는 부화를 통해 여과 인공 해수에서 생존 이후의 유전자 발현 또는 조직 학적 분석 7 고정 할 수 있으며, 자세한 준비 테이블 개발 (5)를 통해 진행 상황을 정확하게 식별 할 수 있습니다. 강력한 프로토콜 현장 하이브리드 8-15 또는 4,16,17를 면역 염색에 의해 유전자 발현 분석을 수행하는 데 사용되었습니다, RNA 간섭 (13, 15) 또는 morpholinos와 12 및 안정 세균 라인으로 기능 최저는 18 형질 전환. 형질 전환 시스템, 유도 식 14 및 19의 방법은 또한 P.의 유전자 기능을 연구하기 위해 이용 될 수있는 인핸서 트랩을 사용 hawaiensis. 공개 된 게놈 시퀀스는 현재 사용할 수 없습니다 있지만, 난자 및 배아 동안 생산 된 성적 증명서를 포함하는 전 사체는 꿀벌을 가지고N 드 노보 조립 및 20 주석, 유전자 발견을 용이하게 검색 할 수있는 데이터베이스 (21)에 입금. 요컨대, P. hawaiensis 개발을 이해하는 여러 실험과 유전자 접근 방식에 적합한 매우 다루기 쉬운 모델 생물이다.
D의 초기 세포 융합 분열과 달리 의 melanogaster, P. hawaiensis 배아 holoblastically 수정 (그림 2A)를 다음 절단. 리니지 추적 분석은 세 번째 분열에 의해, 세 번째 분열 할구 각각 구체적으로 세 가지 세균 층의 하나 또는 세균 라인 (6) (그림 2B)로 야기 운명되는 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 함께 마이크로 어레이 데이터 (22)와, 세포 계보는 6,23를 분석하고 할구 분리 실험 4는 개발 잠재력이 CEL의 비대칭 상속에 의해 적어도 일부의 세 번째 분열 할구를 분리합니다 것을 제안했습니다L 운명 결정. 세포의 부재로 표시된 바와 같이 따라서, (Parhyale 세포 계보 명명법 6에서 "g"라고) 세균 라인 전구체 팔 세포 단계에서 제거되는 할구 박리 실험에서, 배아는 나중에 개발 단계 4에서 생식 세포가 결여 대부분의 후생 동물 (24)의 세균 라인 마커 단백질 바사을 표현. 대조적으로, 체세포 할구 절제 실험은 보여 주었다 P. hawaiensis 배아는 상당한 규제 기능을 가지고 여덟 세포 단계에서 절제 중배엽 또는 외배엽 전구체 할구의 운명은 나머지 할구 (25)의 일부의 자손에 의해 인수 될 수 있도록. 어떻게 규정하는 세포의 운명 교체가 발생할 수 및 체세포 할구에 의한 자율적 인 세포의 운명 채용의 정도는 알 수없는 남아있다. 이러한 할구 절제와 같은 실험 발생학 기술은 understan에 유용 할 수 있습니다딩은 상대적 자율성과 세포의 운명 결정 (26, 27)의 nonautonomy 및 P.의 연구에 관심 그러므로입니다 hawaiensis의 배아.
외배엽 및 중배엽 계통의 규정하는 대체를 보여 실험에서 할구 절제 사출 (28)과 광독성 염료 (25)의 다음 여기에 의해 수행되었다. 이 기술은 주입 된 할구 (들)을 죽이는 효과가 있지만, 그것은 완전히 배아에서 죽은 세포의 시체를 제거하지 않습니다. 또한, 차이는 세포 계보 형광 계보 트레이서 (28, 29)와 할구를 주입하여 배아의 낭 배기 단계를 통해 수집 된 데이터를 동일한 배아 단계 23의 개발을 통해 교란 할구에 따라 수집 된 데이터 사이에 관찰되었다. 특정 할구의 완전한 물리적 제거 따라서 일부 응용 프로그램 제거하는 바람직한 방법이 될 수 있습니다.
우리는 이전에 세포 계통의 결과를 발표하는 것은 하나의 세포가 수동으로 23을 절제 하였다있는 배아의 분석. 그러나, 초기 분열 단계의 배아에서 단일 할구를 제거하는 데 필요한 섬세한 작업은 아직 완전히 설명하지 않았다. 여기에서 우리는 P.의 수집을위한 프로토콜을 제시한다 hawaiensis 배아와 여덟 세포 단계의 배아에서 하나의 할구를 수동으로 제거. 이 방법의 목적은 셀룰러 동작 및 배아 발생 및 후 배아 발달 동안 남아있는 세포의 세포 운명 역량의 관찰을 허용 배아에서 전지 본체의 완전한 제거를 달성하는 것이다. 우리 프로토콜 세균 선 g 전구체 (도 2c)의 제거를 도시하지만, 이하 절단 단계 할구에, 팔 세포 단계에서 모든 셀에인가 될 수있다. 원칙적으로,이 프로토콜은 인접 초기 분열 단계 배아에서 단일 세포를 제거하도록 적용될 수있다R holoblastically 해양 무척추 동물을 쪼개기.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 수동 제거 및 amphipod P.의 초기 분열 단계에서 단일 할구의 완전한 물리적 인 제거를위한 프로토콜을 설명 hawaiensis. 우리는 여덟 세포 단계의 배아에서 단일 배아 줄 전구 세포의 g를 제거하여이 의정서의 사용을 설명하고, 절제 나중에 배아에서 g의의 딸 세포의 유무를 확인하여 성공했는지 보여줍니다. 이 프로토콜은 초기 분열 단계에서 배아로부터 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 카메라 작업에 Tripti 굽타와 Frederike Alwes 세포 제거 기술을 정제 도움, 데이터, 비디오 및 원고에 대한 의견을 Extavour 실험실 구성원을 Rayhan 아리프와 Hassaan Shahawy 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 하버드 줄기 세포 연구소에 의해 지원되었다 (씨 그랜트 번호 SG-0057-10-00) 엘리슨 의료 재단 (새로운 학술 보너스 번호 AG-NS-07010-10) CGE에, 하버드 대학 연구 프로그램 상에 ARN.
Materials
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 | For making mouth pipette tips. VWR |
| 3 cm petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR |
| 48-well plates | Greiner Bio-One | 82051-004 | For culturing embryos following ablation. VWR |
| Bottle top filters 0.2 micron | Nalge Nunc International | 28199-296 | For creating FASW (See below) VWR |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 | Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich |
| Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 | need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 | Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA | Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems |
References
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