Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l'evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Abstract

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un piccolo crostaceo trovato in intercotidali habitat marini di tutto il mondo. Negli ultimi dieci anni, Parhyale è emerso come organismo modello promettente per studi di laboratorio di sviluppo, fornendo un confronto outgroup utile al ben studiato modello artropodi organismo Drosophila melanogaster. In contrasto con le fratture sinciziale di Drosophila, i primi divisioni di Parhyale sono holoblastic. Mappatura Fate utilizzando coloranti traccianti iniettati nel primi blastomeri hanno dimostrato che tutti e tre i foglietti embrionali e la linea germinale sono stabiliti dallo stadio di otto cellule. In questa fase, tre blastomeri predestinati per dare luogo alla ectoderma, tre sono destinata a dare origine al mesoderma, e gli altri due blastomeri sono rispettivamente i precursori della linea endoderma e germe. Tuttavia, gli esperimenti di ablazione blastomeri hanno dimostrato che gli embrioni Parhyale possiedono anche significativo capabiliti normativoes, in modo tale che i destini di blastomeri ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti blastomeri. Blastomere ablazione è stato precedentemente descritto da uno dei due metodi: iniezione e successiva attivazione di coloranti fototossiche o ablazione manuale. Tuttavia, fotoablazione uccide blastomeri ma non rimuove il corpo cellulare morto dall'embrione. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Qui vi presentiamo un protocollo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri dalla fase di otto cellule di embrioni Parhyale, illustrando gli strumenti e le procedure manuali necessarie per la rimozione completa del corpo cellulare mantenendo vivo e intatto rimanenti blastomeri. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cella Parhyale allo stadio di otto cellule, o blastomeri di altre fasi iniziali della scissione. Inoltre, in linea di principio questo protocollo possa essere applicabile ai primi di CleaVage embrioni stadio di altri invertebrati marini holoblastically fendendo.

Introduction

Il Parhyale hawaiensis anfipode crostaceo è emerso negli ultimi dieci anni come organismo modello promettente con un grande potenziale per l'uso in biologia dello sviluppo evolutivo di ricerca ^1. Tra gli artropodi, la maggior parte dei sistemi modello sono insetti, e il più ampiamente studiati di questi è il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. D. melanogaster è un membro dell'ordine dei Ditteri insetti, e come tale visualizza molte caratteristiche embrionali derivate rispetto a quelli degli insetti basally ramificazione ^2. Inoltre, gli insetti sono annidati all'interno del subphylum Pancrustacea ^3, il che significa che gli insetti hanno i loro parenti più stretti all'interno del gruppo di lunga data "naturale" chiamato pancrustaceans, e che questo gruppo è parafiletico. Ciò suggerisce che oltre alla ramificazione basally modelli insetti, studi di altri crostacei sono necessari per ottenere una visione più ampia della storia evolutiva dei tratti di sviluppo unmeccanismi molecolari nd che sono stati così ben studiate in D. melanogaster. Tuttavia, poche crostacei sono stati ben stabiliti per analisi di laboratorio sperimentale di sviluppo. Il anfipode P. hawaiensis è altamente trattabile sistema modello di laboratorio, suscettibili di una serie di tecniche sperimentali. Anfipodi mostrano molte caratteristiche uniche nel loro superorder genitori Peracarida (tramogge spiaggia, scudi, e gamberetti così), e sono quindi pensati per essere relativamente derivato all'interno di questo gruppo di crostacei. Tuttavia, la relativa facilità di manipolazione genetica embrionale e funzionale offerto da Parhyale rendono questo anfipode una preziosa aggiunta alla corrente inventario di organismi modello.

Come un animale da laboratorio, P. hawaiensis offre molti vantaggi. Gli animali sono tolleranti ad una vasta gamma di temperature e salinità, e sopravvivono bene in grandi culture di acqua di mare artificiale ^1. E 'facile distinguere between maschi e femmine sulla base di differenze morfologiche evidenti, più in particolare, i grandi, uncinate, appendici tronco anteriori che i maschi usano per afferrare le femmine durante l'accoppiamento. Per il lavoro embrionale e dello sviluppo, P. hawaiensis ha diverse caratteristiche molto interessanti. Embriogenesi dura circa 10 giorni e il tempo per la maturità sessuale è di circa sei settimane a 28 ° C (ma si noti che Parhyale sopravvive bene a temperature che variano da circa il 20-30 º C, e che informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C ⁴ , 25 ° C ^4, e 26 ° C ^5,6). Adulti si accoppiano tutto l'anno in laboratorio, in modo da embrioni sono disponibili in qualsiasi periodo dell'anno. Le femmine depongono 2-20 (a seconda dell'età delle donne) uova fecondate in un sacchetto covata ventrale che si trova tra le prime paia di zampe (Figure 1A e 1B), ed è possibile raccogliere questi embrionis molto presto nello sviluppo senza uccidere la femmina o danneggiare gli embrioni (Figura 1C). Gli embrioni sopravvivono in acqua di mare artificiale filtrata fino alla schiusa, possono essere fissati per l'espressione genica o successiva analisi istologica ^7, e una tabella dettagliata di gestione temporanea permette l'identificazione precisa dei progressi attraverso lo sviluppo ^5. Protocolli robusti sono stati utilizzati per effettuare analisi di espressione genica mediante ibridazione in situ ^8-15 o immunoistochimica ^4,16,17, knockdown funzionale mediante RNA interference ^13,15 o Morpholinos ^12, e la linea germinale stabile transgenesi ^18. Utilizzando il sistema di transgenesi, espressione inducibile ¹⁴ e trappola enhancer ¹⁹ metodi possono anche essere usati per studiare la funzione del gene in P. hawaiensis. Mentre una sequenza del genoma a disposizione del pubblico non è al momento disponibile, un trascrittoma contenente le trascrizioni prodotta durante oogenesi e embriogenesi ha apen de novo assemblati e annotati ^20, e depositati in un database consultabile ^21, facilitando la scoperta del gene. In sintesi, P. hawaiensis è un organismo modello molto maneggevole adatto per molteplici approcci sperimentali e genetici per comprendere lo sviluppo.

A differenza delle prime fratture sinciziale di D. melanogaster, P. embrioni hawaiensis fendere holoblastically segue fecondazione (Figura 2A). Lineage tracing analisi ha mostrato che dal terzo clivaggio, ciascuno dei terzi blastomeri scissione è specificamente destinata a dare origine ad uno dei tre strati germinali o la linea germinale ⁶ (Figura 2B). Questi dati, insieme ai dati di microarray ^22, linea cellulare analisi ^6,23, e gli esperimenti di isolamento blastomere ⁴ hanno suggerito che le potenzialità di sviluppo sono separate da almeno alcuni terzi blastomeri scissione di eredità asimmetrica del cell determinanti destino. Pertanto, in esperimenti blastomere ablazione in cui il precursore linea germinale (chiamato "g" nella linea cellulare nomenclatura Parhyale ⁶⁾ è stato rimosso nella fase otto cellule, embrioni mancavano cellule germinali in successivi stadi di sviluppo ^4, come indicato dall'assenza di cellule esprimendo la proteina Vasa, che è un marker germinale nella maggior metazoi ^24. Al contrario, somatiche esperimenti ablazione blastomeri hanno mostrato che P. embrioni hawaiensis possiedono anche notevoli capacità di regolamentazione, in modo tale che le sorti del mesoderma o ectoderma blastomeri precursori ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti ²⁵ blastomeri. Come regolativo sostituzione destino delle cellule può verificarsi, e il grado di autonomia adozione destino delle cellule somatiche da blastomeri, rimane sconosciuto. Sperimentali tecniche embriologiche come blastomere ablazione può essere utile a comprending l'autonomia relativa e nonautonomy delle decisioni destino delle cellule ^26,27 e sono quindi di interesse per lo studio di P. hawaiensis embriogenesi.

Negli esperimenti che hanno dimostrato la sostituzione regolatore del ectodermici e mesodermici lignaggi, ablazione blastomeri è stata eseguita mediante iniezione ²⁸ e la successiva eccitazione coloranti fototossiche ^25. Mentre questa tecnica è efficace a uccidere il blastomeri (s) iniettato, non rimuove completamente il corpo cellula morta dall'embrione. Inoltre, sono state osservate differenze tra i dati raccolti attraverso il lignaggio delle cellule agli stadi gastrulazione dell'embriogenesi iniettando blastomeri con traccianti fluorescenti lignaggio ^28,29, ei dati raccolti seguendo blastomeri imperturbati attraverso lo sviluppo degli stessi stadi embrionali ^23. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni.

Abbiamo già pubblicato i risultati della linea cellulare analisi degli embrioni in cui singole cellule sono state asportato manualmente ^23. Tuttavia, le delicate operazioni necessarie per rimuovere i singoli blastomeri dai primi scissione embrioni fase non sono ancora state pienamente descritte. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di P. embrioni hawaiensis e ablazione manuale di un singolo blastomero da un embrione di otto cellule. L'obiettivo di questo metodo è quello di ottenere la rimozione completa del corpo cellulare dall'embrione, che permette l'osservazione dei comportamenti cellulari e competenze destino cellulare delle restanti cellule durante l'embriogenesi e sviluppo post-embrionale. Il nostro protocollo mostra rimozione del precursore g germinale (Figura 2C), ma può essere applicato a qualsiasi cella nella fase di otto cellule, o di blastomeri di scissione fasi precedenti. In linea di principio, questo protocollo potrebbe essere applicato a rimuovere le singole cellule da embrioni precoci fase scissione di Other holoblastically cleaving invertebrati marini.

Protocol

Commenti che possono essere utili in esecuzione di alcuni passaggi sono indicati in corsivo. 1. Giorno 1: Preparazione dei Materiali Preparare i seguenti materiali (cfr. tabella dei Materiali e attrezzature): 15 cm e 22 cm pipette Pasteur Diamante scriba acqua di mare artificiale filtrata (salinità tra 0,0018-0,0020) contenente 1 mg / ml di amfotericina B (1:100 di una soluzione madre di 100 mg / ml), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina …

Representative Results

Dopo il successo ablazione del singolo terzi scissione P. micromeri hawaiensis come descritto in questo protocollo, i restanti micromeri progressivamente spostano le loro posizioni leggermente in modo da occupare parzialmente lo spazio precedentemente occupato dal blastomero ablato. Per esempio, quando g viene rimosso, la vicina blastomeri mr e ML spostare leggermente e venire a condividere i bordi delle celle laterali che erano precedentemente in diretto contatto con …

Discussion

Descriviamo un protocollo per l'ablazione manuale e rimozione fisica completa di singoli blastomeri dalle fasi iniziali della scissione del anfipode P. hawaiensis. Dimostriamo l'uso di questo protocollo rimuovendo la singola linea germinale cellula precursore g da una fase embrionale di otto cellule, e dimostrare che l'ablazione ha avuto successo, confermando l'assenza di s 'g cellule figlie in embriogenesi più tardi. Questo protocollo può essere utilizzat…

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems