Ablasjon av en enkelt celle fra åtte-cellers embryo av amfi Crustacean<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

Amfi Parhyale hawaiensis er en lovende modellorganisme for studier av krepsdyr embryologi og komparativ leddyr utvikling og evolusjon. Denne protokollen beskriver en metode for manuell fjerning av enkelt blastomeres fra tidlig cleavage stadium embryoer fra Parhyale.

Abstract

Amfi Parhyale hawaiensis er et lite krepsdyr som finnes i fjæra marine naturtyper over hele verden. I løpet av det siste tiåret, har Parhyale dukket opp som en lovende modellorganisme for laboratoriestudier av utviklingen, og gir en nyttig outgroup forhold til godt studert leddyr modellorganisme Drosophila melanogaster. I motsetning til de syncytialt spaltinger på Drosophila, tidlig spaltinger på Parhyale er holoblastic. Fate kartlegging ved hjelp av sporingsstoffer injiseres i tidlig blastomeres har vist at alle tre bakterie lag og spiren linjen er etablert av de åtte-cellers stadiet. På dette stadiet, er tre blastomeres skjebnebestemt til å gi opphav til ektoderm, er tre skjebnebestemt til å gi opphav til mesoderm, og de resterende to blastomeres er forløperne til endoderm og bakterie linjen hhv. Imidlertid har blastomere ablasjon eksperimenter vist at Parhyale embryoer også besitter betydelig regulatorisk capabilities, slik at skjebnen til blastomeres ablasjon ved åtte-cellers stadiet kan bli overtatt av etterkommere av noen av de gjenværende blastomeres. Blastomere ablasjon er tidligere beskrevet av en av to metoder: injeksjon og påfølgende aktivering av fototoksiske fargestoffer eller manuell ablasjon. Men Photoablation dreper blastomeres men ikke fjerner døde celler kroppen fra embryo. Fullstendig fysisk fjerning av spesifikke blastomeres kan derfor være en foretrukket metode for ablasjon i noen anvendelser. Her presenterer vi en protokoll for manuell fjerning av enkelt blastomeres fra åtte-cellers stadiet av Parhyale embryoer, illustrerer instrumenter og manuelle prosedyrer som er nødvendige for fullstendig fjerning av cellen kroppen mens du holder de resterende blastomeres levende og intakt. Denne protokollen kan brukes på alle Parhyale celle på åtte-cellers stadiet, eller til blastomeres av andre tidlig cleavage etapper. I tillegg, i prinsippet denne protokollen kan være aktuelt for tidlig CleaVåge stadium embryo av andre holoblastically spaltingsprober marine virvelløse dyr.

Introduction

Amfi krepsdyr Parhyale hawaiensis har dukket opp det siste tiåret som en lovende modellorganisme med stort potensial for bruk i evolusjonær utviklingsbiologi forskning ^en. Blant de leddyr, de fleste modellsystemer er insekter, og den mest omfattende studert av disse er bananflue Drosophila melanogaster. D. melanogaster er medlem av insekt orden Diptera, og som sådan viser mange embryologiske funksjoner som er utledet med hensyn til de av basalt forgrening insekter ^to. Videre er insekter nestet i subphylum Pancrustacea ^3, noe som betyr at insekter har sine nærmeste slektninger i den langvarige "naturlig" gruppe kalt pancrustaceans, og at denne gruppen er paraphyletic. Dette tyder på at i tillegg til basalt forgrening insekt modeller, er studier av andre krepsdyr som kreves for å få et bredere syn på den evolusjonære historien til de utviklingstrekk ennd molekylære mekanismer som har blitt så godt undersøkt i D. melanogaster. Imidlertid har svært få krepsdyr blitt godt etablert for eksperimentelle laboratorieanalyse av utviklingen. Amfi P. hawaiensis er en svært medgjørlig laboratorie-modell-system, mottagelig for en rekke eksperimentelle teknikker. Amfipoder vise mange unike funksjoner innenfor deres foreldre superorder Peracarida (strand hoppers, scuds, og vel reker), og er derfor antatt å være relativt avledet innenfor denne gruppen av krepsdyr. Likevel, det er relativt enkelt for embryological og funksjonell genetisk manipulasjon tilbys av Parhyale gjøre dette amfipode et verdifullt tillegg til den nåværende beholdning av modellorganismer.

Som forsøksdyr, P. hawaiensis gir mange fordeler. Planter er tolerant for et vidt område av temperaturer og saliniteter, og overleve godt i store kulturer av kunstig sjøvann ^1.. Det er lett å skille between hanner og hunner basert på klare morfologiske forskjeller, særlig, de store, hektet, fremre trunk vedheng at menn bruker for å forstå kvinner under parring. For embryological og utviklingsarbeid, P. hawaiensis har flere svært tiltalende funksjoner. Embryo varer ca 10 dager og tid til kjønnsmodning er ca seks uker ved 28 º C (men merk at Parhyale overlever godt ved temperaturer fra ca 20-30 º C, og at detaljert utviklings iscenesettelse informasjon er tilgjengelig for embryoer hevet ved 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, og 26 º C ^5,6). Voksne mate hele året i laboratoriet, slik at embryoer er tilgjengelig når som helst på året. Hunner lå 2-20 (avhengig av alderen av de kvinnelige) befruktede egg i en ventral rugepose plassert mellom de første par bein (figurene 1A og 1B), og det er mulig å samle disse embryoer veldig tidlig i utviklingen uten å drepe den kvinnelige eller ødelegger embryoer (figur 1C). Embryoene overleve i filtrert kunstig sjøvann gjennom til klekking, kan fikses for påfølgende genekspresjon eller histologisk analyse ^7, og en detaljert rekkefølgetabell gir nøyaktig identifisering av fremdriften gjennom utvikling ^fem. Robuste protokoller har blitt brukt genekspresjonsanalyser å utføre ved in situ hybridisering ^8-15 eller farging ^4,16,17, funksjonell knockdown av RNA interferens ^13,15 eller Morpholinos ^12, og stabile kjønnsceller transgenesis ^18. Ved hjelp av transgenesis system, induserbar ekspresjon ¹⁴ og enhancer-felle ¹⁹ fremgangsmåter kan også brukes til å undersøke gen-funksjon i P. hawaiensis. Mens en offentlig tilgjengelig genomsekvens er ikke tilgjengelig for øyeblikket, har en transcriptome inneholder transkripsjoner produsert under oogenesen og embryogenesis been de novo montert og kommentert ^20, og deponert i en søkbar database ^21, å legge til rette genet oppdagelse. I sum, P. hawaiensis er en svært medgjørlig modell organisme egnet for flere eksperimentelle og genetiske tilnærminger til å forstå utviklingen.

I motsetning til de tidlige syncytialt spaltinger på D. melanogaster, P. hawaiensis embryoer holde seg holoblastically etter befruktning (Figur 2A). Avstamning tracing analyse har vist at ved tredje spalting, er hver av de tredje cleavage blastomeres spesifikt dømt til å gi opphav til en av de tre bakterie lag eller spiren linje ⁶ (figur 2B). Disse dataene, sammen med microarray data ^22, analyserer celle avstamning ^6,23, og blastomere isolasjon eksperimenter ⁴ har antydet at utviklingspotensialer er segregert til minst noen tredje cleavage blastomeres av asymmetrisk arv av cell skjebne determinanter. Følgelig, i blastomere ablasjon eksperimenter hvor spiren linje forløper (betegnet "g" i Parhyale celle lineage nomenklatur ⁶⁾ ble fjernet ved åtte cellestadiet, embryoer manglet kimceller på senere utviklingsstadier ^4, som vist ved fravær av cellene uttrykker proteinet Vasa, som er en bakterie linje markør i de fleste metazoans ^24. I kontrast, somatiske blastomere ablasjon eksperimenter viste at P. hawaiensis embryoer også ha betydelige regulatoriske evner, slik at skjebnen til mesoderm eller ektoderm forløper blastomeres ablasjon ved åtte-cellers stadiet kan bli overtatt av etterkommere av noen av de gjenværende blastomeres ^25. Hvordan regulative celle skjebne erstatning kan oppstå, og omfanget av selvstendig celle skjebne adopsjon av somatiske blastomeres, forblir ukjent. Eksperimentelle embryologiske teknikker som blastomere ablasjon kan være nyttig i forståelseding den relative autonomi og nonautonomy av celle skjebne beslutninger ^26,27 og er derfor av interesse i studiet av P. hawaiensis embryogenese.

I forsøkene som viste regulative utskifting av ectodermal og mesodermal linjene, ble blastomere ablasjon utføres ved injeksjon ²⁸ og påfølgende eksitasjon av fototoksiske fargestoffer ^25. Selv om denne teknikken er effektiv på å drepe den injiserte blastomere (s), betyr det ikke helt fjerne døde celler kroppen fra embryo. I tillegg har forskjellene blitt observert mellom celle avstamning data samlet gjennom å gastrulation stadier av embryogenesis ved å injisere blastomeres med fluorescerende avstamning tracere ^28,29, og data samlet av følgende uaffisert blastomeres gjennom utvikling av de samme embryonale stadier ^23. Fullstendig fysisk fjerning av spesifikke blastomeres kan derfor være en foretrukket metode for ablasjon i noen anvendelser.

Vi har tidligere publisert resultatene av celle avstamning analyser av befruktede egg der enkeltceller ble manuelt ablasjon ^23. Men de delikate operasjoner som kreves for å fjerne enkelt blastomeres fra tidlig cleavage stadium embryoer har ennå ikke blitt fullstendig beskrevet. Her presenterer vi en protokoll for samling av P. hawaiensis embryoer og manuell ablasjon av en enkelt blastomere fra en åtte-cellers stadiet embryo. Målet med denne metoden er å oppnå fullstendig fjerning av cellekroppen fra embryo, slik at observasjon av mobiltelefon atferd og celle skjebne kompetansen til de resterende celler under embryogenesis og post-embryoutvikling. Vår protokoll viser fjerning av bakterie linje forløper g (figur 2C), men kan anvendes på en hvilken som helst celle på åtte-cellestadiet, eller for å blastomeres av tidligere cleavage stadier. I prinsippet kan denne protokollen brukes til å fjerne enkeltceller fra tidlig cleavage stadium embryo av a.r holoblastically spalte marine virvelløse dyr.

Protocol

Kommentarer som kan være nyttig i å gjennomføre visse tiltak er angitt i kursiv. En. Dag 1: Utarbeidelse av materialer Forbered følgende materialer (se tabell av materialer og utstyr): 15 cm og 22 cm Pasteur pipetter Diamond spiss Filtrert kunstig sjøvann (saltinnhold mellom 0,0018 til 0,0020) inneholdende 1 mg / ml amfotericin B (1:100 av en 100 mg / ml stamløsning), 100 enheter / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin (01:50 av en stamløsning inneholde…

Representative Results

Etter vellykket ablasjon av enkelt tredje cleavage P. hawaiensis micromeres som beskrevet i denne protokollen, de resterende micromeres gradvis skifte sine posisjoner litt slik som å delvis okkupere plassen tidligere okkupert av den tyreoideaektomi blastomere. For eksempel, når g er fjernet, nabo blastomeres mr og ml skiftet litt, og kommer til å dele den laterale cellegrensene som tidligere var i direkte kontakt med g (sammenlign fi…

Discussion

Vi beskriver en protokoll for manuell ablasjon og fullstendig fysisk fjerning av enkelt blastomeres fra tidlige cleavage stadier av amfi P. hawaiensis. Vi demonstrere bruken av denne protokollen ved å fjerne én bakterie linjen forløper celle g fra en åtte-cellers stadiet embryo, og vise at ablasjon har vært vellykket ved å bekrefte fravær av g 's datter celler i senere embryogenese. Denne protokollen kan brukes for å fjerne en hvilken som helst av de micromeres fra …

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems