Summary
نحن هنا تصف طريقة للتعبير عن مستضدات سطح فيروس الانفلونزا مطوية بشكل صحيح وظيفية المستمدة من فيروس H7N9 الصينية الرواية في خلايا الحشرات. تقنية يمكن تكييفها للتعبير عن ectodomains من أي البروتينات السطحية الفيروسية أو الخلوية.
Abstract
نظام التعبير الفيروسة العصوية هو أداة قوية للتعبير عن البروتينات المؤتلف. نحن هنا استخدامه لإنتاج نسخ مطوية بشكل صحيح والغليكوزيلاتي من الأنفلونزا فيروس بروتين السطح - على راصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA). كمثال على ذلك، اخترنا HA و NA البروتينات التي أعرب عنها فيروس H7N9 الرواية التي ظهرت مؤخرا في الصين. ومع ذلك البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لHA و NA البروتينات التي أعربت عنها أي الأنفلونزا الأخرى وسلالات الفيروس (ب). المؤتلف HA (رحه) وNA (RNA) والبروتينات هي الكواشف هامة لفحوصات المناعية مثل ELISA ELISPOT و، وأيضا في استخدام واسع لتوحيد اللقاح، واكتشاف الأجسام المضادة، والعزلة وتوصيف. علاوة على ذلك، جزيئات NA المؤتلف يمكن استخدامها للكشف عن مثبطات جزيء صغير ومفيدة لتوصيف وظيفة الأنزيمية للNA، وكذلك حساسيتها للمضادات الفيروسات. البروتينات HA المؤتلف أيضا باياختبار لقاحات تجريبية نانوغرام في النماذج الحيوانية، وتم الترخيص لقاح استنادا المؤتلف HA مؤخرا من قبل ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام في البشر. طريقة وصفنا هنا لإنتاج هذه الجزيئات هو مستقيم إلى الأمام، ويمكن أن تسهل البحث في مختبرات الأنفلونزا، نظرا لأنه يسمح لإنتاج كميات كبيرة من البروتينات بسرعة وبتكلفة منخفضة. على الرغم من هنا ونحن نركز على بروتينات سكرية سطح فيروس الانفلونزا، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لإنتاج غيرها من البروتينات السطحية الفيروسية والخلوية.
Introduction
كرد فعل أول من ظهور الأخيرة من إنفلونزا H7N9 سلالة الفيروس رواية في الصين، ونحن اكتسبت البلازميدات تحمل تسلسل الجيني لراصة دموية (HA) والنورامينيداز (NA) جينات العزلات الأولين. باستخدام هذه البلازميدات كنا قادرين على بناء ناقلات التعبير baculoviral بسرعة لإنتاج المؤتلف HA و NA في خلايا الحشرات. تم تأسيس هذا النظام التعبير بشكل جيد في مختبرنا وأثبتت محوريا في العديد من مشاريعنا البحثية الجارية 1-8. خلايا الحشرات قادرون على أضعاف بشكل صحيح وبعد translationally تعديل البروتينات المعقدة. وتشمل هذه التعديلات ارتباط بالغليكوزيل N-مرتبط، وهو أمر مهم بالنسبة للعديد من البروتينات السكرية الفيروسية. على هذا النحو، فإنه ليس من المستغرب أن نظام الفيروسة العصوية يتم تأسيس جدا للتعبير عن مستضدات سطح فيروس الأنفلونزا. في الواقع، فإن العديد من هياكل الكريستال HA و NA تم حلها باستخدام الخلايا أعرب بروتينات الحشرات 9-11. ميزة أخرى للالنظام تكمن في موثوق عوائد عالية من البروتين تصل إلى 30 ملغ من خلية ثقافة HA / L (بناء على خبرتنا مع أكثر من 50 البروتينات HA مختلفة) - نتيجة لفيروس العدوى التعبير طردوا من المروج polyhedrin قوية.
إزالة الغشاء وendodomain من HA و NA البروتينات يسمح للتعبير عن الإصدارات secretable قابلة للذوبان من البروتينات، وبالتالي يسهل كثيرا من عملية تنقية. بالإضافة إلى ذلك، هذه ectodomains يتم hexahistidine الموسومة، وبالتالي يمكن تنقيتها باستخدام تقارب اللوني باستخدام ني 2 + الراتنج. المجالات عبر الغشاء من HA و NA البروتينات تسهم في homotrimer وتشكيل homotetramer، على التوالي. من أجل الحفاظ على هذه oligomerizations، ونحن إضافة trimerization المجال C محطة لHA-، وtetramerization المجال-N محطة ليبني NA (الشكل 1). أظهرنا بشكل قاطع أن هذا المجال trimerization استقرار وظيفي، العواقبrved الحواتم بتكوين على ساق المجال من HA 1. وtetramerization الصحيح للNA قد تسهم أيضا في تصحيح للطي وظيفة NA 10. يمكن طلب متواليات وناقلات baculo نقل إيواء trimerization أو tetramerization المجالات من المؤلفين أو من غيرها من المختبرات في هذا المجال، 9،10،12.
مسألة هامة أخرى للتعبير عن البروتينات في الخلايا تفرز الحشرة هو اختيار خط الخلية اليمنى. بينما تستمد ورق القطن frugiperda خلايا Sf9 الفيروسة العصوية دعم النسخ المتماثل بشكل جيد للغاية، وتستخدم عموما لإنقاذ الفيروس وانتشار، فقد القدرة على إفراز كميات كبيرة من البروتين محدودة. المستمدة Trichoplusia ني BTI-TN-5B1-4 خلايا (المعروف باسم ارتفاع خمسة) لديها قدرة أعلى وإفراز هي خط خلية من خيار للتعبير في هذا البروتوكول 13،14. وعلاوة على ذلك، فإنه من المفيد لخفض أو حتى إزالة مصل بقري جنيني (الفيس بوكS) من ثقافات التعبير. لذا فإننا استخدام وسائل الإعلام مع انخفاض (3٪) المحتويات FBS لنمو مخزونات فيروس العمل، ونحن أداء التعبير البروتين في وسائل الإعلام الحرة في المصل.
وتستخدم المؤتلف HA و NA البروتينات المناعية لكثير من التقنيات. ربما كان أكثرها شيوعا هو في فحوصات ELISA لقياس تحويل مصل التطعيم على في البشر أو الحيوانات 4،6،7،15. وقد وتستخدم أيضا الوافدين الجدد في المقايسات ELISPOT على حد سواء جزيئات تنشيطية والكواشف كشف عن الأجسام المضادة إفراز الخلايا 16. استخدامهم الطعوم الجزيئية تسمح لفرز خصيصا لplasmablasts أو أنواع أخرى من الخلايا البائية التي يمكن استخدامها لعزل (العلاجية) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS). وكذلك تستخدم المؤتلف HA و NA الجزيئات في توصيف هذه MABS 8. ومن الأمثلة الأخرى دراسة استقرار درجة الحموضة أو مستقبلات خصوصية قد أعربت عنها عزلات فيروس مختلفة، أو تقييم كمي NA الأنزيمية محددةالنشاط أو مقاومة للمثبطات. علاوة على ذلك، المؤتلف، HA تنقيته يمكن استخدامها لتوحيد المحتوى HA لقاحات فيروس الأنفلونزا المعطل.
الأهم من ذلك، رحه (وإلى درجة معينة NA) ويجري حاليا اختبار اللقاحات المرشحة في النماذج الحيوانية وتجارب اكلينيكية على البشر مع المرشح لقاح واحد يجري ومرخصة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير في عام 2013 2،17-19. في الاستفادة من هذه اللقاحات الرواية هو أنه، نظرا لطبيعة المؤتلف من هذه البروتينات، يمكن تجنب عملية كثيفة العمالة من توليد النمو المرتفع الفيروسات المتفارز. ربما أكثر أهمية هو حقيقة أن العائد HA لاعبيها عالية واستنساخه من سلالة إلى سلالة. أيضا، منذ ويتم إنتاج هذه اللقاحات في نظام خالية من البيض، وأنها لا تحتوي على الملوثات البروتين التي هي مشكلة بالنسبة للأشخاص الذين يعانون من الحساسية البيض.
نحن هنا اختار للتعبير عن HA و NA البروتينات من العزلات اثنين من الصينيين فيروس الانفلونزا H7N9 الرواية، A / آنهui/1/13 وA/Shanghai/1/13 20،21. هذه أمثلة في الوقت المناسب، ولكن وصفها بروتوكول يمكن استخدامها للتعبير عن أي وباء الأنفلونزا A HA NA أو البروتينات ويمكن تكييفها للتعبير عن أي البروتينات الفيروسية أو الخلوية يفرز الأخرى. يمكن استنساخ البروتينات عبر الغشاء مثلوثي أو رباعي القسيمات في أشرطة التعبير المستخدم لHA و NA، على التوالي. ومع ذلك، يفرز معظم البروتينات الخلوية القابلة للذوبان، مثل إنترفيرون على سبيل المثال، لا تحتاج إلى مجال إضافية لتحقيق الاستقرار ويمكن التعبير عنها فقط مع علامة hexahistidine-C المحطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد المؤتلف الفيروسة العصوية
- الاستنساخ في نقل الفيروسة العصوية-البلازميدات
- استنساخ H7 HA NA وN9 ectodomain (أو أي HA NA أو الجينات الأخرى) إلى تعديل البلازميدات نقل pFastBac (انظر المقدمة). ناقلات لHA يحتوي على نطاق trimerization-C محطة وعلامة hexahistidine، فضلا عن NA تحتوي على مجال tetramerization N-محطة وعلامة hexahistidine، وقد وصفت 1،10،11،22 (الشكل 1)، ويمكن أن يطلب من المؤلفين.
مذكرة تفسيرية: سيتم طيها ectodomains HA أعرب بدون مجال trimerization بشكل غير صحيح، مما يؤدي إلى فقدان الحواتم تحييد متعلق بتكوين جزئي، وخاصة في المجال ساق. وبالمثل، تعتمد وظيفة الأنزيمية NA على tetramerization المناسبة. - جيل من bacmids
تحويل نقل-البلازميدات تحتوي على الفيروسة العصوية HA و NA الجينات في البكتيريا وفقا DH10Bac باستخدام التعبير الفيروسة العصويةنظام فقا لتعليمات الشركة الصانعة. عزل وتنقية bacmids استخدام عدة Midiprep وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 2).
- استنساخ H7 HA NA وN9 ectodomain (أو أي HA NA أو الجينات الأخرى) إلى تعديل البلازميدات نقل pFastBac (انظر المقدمة). ناقلات لHA يحتوي على نطاق trimerization-C محطة وعلامة hexahistidine، فضلا عن NA تحتوي على مجال tetramerization N-محطة وعلامة hexahistidine، وقد وصفت 1،10،11،22 (الشكل 1)، ويمكن أن يطلب من المؤلفين.
- إنقاذ الفيروسة العصوية المؤتلف والتحقق من البروتين التعبير
مذكرة تفسيرية: الخطوات التالية يجب أن تؤديها في جو معقم و مطهر غطاء تدفق الصفحي. تنفيذ هذا الإجراء بشكل مستقل عن HA و NA (أو أي الجينات الأخرى ذات الاهتمام). عادة ما تزرع خلايا الحشرات عند 28 درجة مئوية دون CO 2. تزرع الخلايا Sf9 لهذا البروتوكول بالكامل تنم-FH سائل الإعلام خلية الحشرات تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ القلم بكتيريا * و0.1٪ محلول F68 بلورونيك، إذا لم يذكر خلاف ذلك، وpassaged 1:04 مرتين في الأسبوع. وتزرع خمسة خلايا عالية في المصل وسائل الإعلام الحرة وSFX passaged 1:15 مرتين في الأسبوع.
* ينبغي النظر في إضافة المضادات الحيوية في جميع أنحاء بروتوكول اختياري وتعديلها وفقا للممارسات المستخدمة في كل مختبر.- لوحة خلايا الحشرات Sf9 في 6 لوحات جيدة في كثافة 2 × 10 5 خلية / سم 2 وترك الجلوس لمدة 20 دقيقة في حاضنة 28 درجة مئوية (دون CO 2).
- خلط 2 ميكروغرام (conc. 0.5-2 ميكروغرام / شباط) من bacmid المؤتلف مع 100 ميكرولتر من تنم-FH المتوسطة (المصل مجانا، 1٪ القلم بكتيريا). مزيج 6 ميكرولتر من وكيل ترنسفكأيشن مع 100 ميكرولتر من تنم-FH المتوسطة (المصل الحرة، القلم بكتيريا). الجمع بين مجلدين، مزيج بلطف وترك الجلوس لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (خليط ترنسفكأيشن). وتشمل همية ترنسفكأيشن واحد عن السيطرة (الشكل 3).
- إزالة طاف من خلايا Sf9 مطلي (الخلايا سوف الآن التمسك لوحة) واستبدالها مع 2 مل من المصل خالية المتوسطة تنم-FH تحتوي على بكتيريا القلم (1٪). إضافة مجلد كامل من خليط ترنسفكأيشن (من الخطوة 1.2.2) والصخور لوحة 6 جيدا لمدة 5 ثوانى بعناية. احتضان في حاضنة 28 درجة مئوية دون CO 2 لمدة 6 ساعة (الشكل 3).
- استبدال واي وسائل الإعلامعشر وسائل الاعلام تنم-FH كامل الطازجة (تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ القلم بكتيريا و 0.1٪ F68 بلورونيك). احتضان في حاضنة 28 درجة مئوية دون CO 2 لمدة 6 أيام. تحقق الخلايا أحيانا تحت المجهر. وعادة ما تظهر الخلايا المصابة أكبر، مستدير، وتوسيع النوى، والبدء في فصل (الشكل 4).
- حصاد الخلايا والتأكد من البروتين التعبير
- خلايا الحصاد 6 أيام آخر ترنسفكأيشن بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يحتوي طاف على الفيروسة العصوية المؤتلف - وسوف تستخدم لتوليد هذه الأسهم تعمل على الفور، أو يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة سنة.
- للتحقق من بروتين تعبير جمع الكريات و resuspend في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. مزيج 50 ميكرولتر من تعليق مع 50 ميكرولتر من العازلة SDS-PAGE التحميل (التي تحتوي على عامل مختزل). تشغيل SDS-PAGE وإجراء تحليل لطخة غربية مع الأجسام المضادة لمكافحة hexahistidine لتأكيد التعبير الجيني. وتشمل الخلايا من وهميةترنسفكأيشن كما الضوابط السلبية (الشكل 3).
- إعداد مخزونات العمل
- لوحة 5 × 10 5 خلايا Sf9 / سم 2 في T175 سم 2 قارورة وترك الجلوس لمدة 20 دقيقة يسمح لهم نعلق على طبق. استبدال وسائل الإعلام كاملة تنم-FH مع وسائل الاعلام تنم-FH تحتوي على 3٪ FBS (و 1٪ القلم بكتيريا، 0.1٪ F68 بلورونيك).
- تصيب الخلايا مع 100 ميكرولتر من طاف الانقاذ. احتضان في حاضنة 28 درجة مئوية دون CO 2 لمدة 6 أيام وأحيانا إذا تحقق الحصول على الخلايا المصابة (كما هو موضح في الخطوة 1.2.5).
- تدور في 2،000 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، وجمع طاف. هذا هو الآن P2 الأسهم الخاصة بك. ويمكن تخزين هذه الأسهم إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية. كرر الإجراء العدوى باستخدام 100 ميكرولتر من الأسهم P2 لتصيب الخلايا. يسمى الأسهم الناتجة P3 أو الأسهم العاملة، والتي يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية أو استخدامها مباشرة للتعبير البروتين. الأسهم P3 عادة ما تحتوي على 10 <سوب> 7 -10 9 البلاك تشكيل وحدة / مل.
2. التعبير البروتين وتنقية
مذكرة تفسيرية: خلايا Sf9 دعم نمو الفيروسة العصوية بشكل جيد للغاية. ومع ذلك، قدرتها على إفراز كميات كبيرة من البروتين المؤتلف محدودة. لذا نستخدم خط آخر الحشرة الخلية، خمسة خلايا ثانوية، للتعبير عن البروتينات المؤتلف يفرز. هذه الخلايا لا تدعم النسخ المتماثل الفيروسة العصوية إلى التتر عالية جدا 13 ولكن لديها قدرة عالية إفرازية.
- يشبون خمس خلايا عالية
تنمو الخلايا عالية في خمسة SFX خلية الحشرات مستنبت في T175 سم 2 القوارير. مرور كل يوم 01:03. للثقافة 200 مل التعبير سوف تحتاج لزراعة 5 قوارير متموجة. - حصاد واصابة خمسة خلايا عالية
- فصل خمسة خلايا عالية من 5 T175 سم 2 قوارير من خلال الاستفادة من القوارير مع يدك. جمع suspe الخليةnsion ونقل إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي.
- تدور في 1،200 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف بواسطة الصب وتوحيد الكريات عن طريق إعادة التعليق عليها في 15 مل من الأسهم P3.
- اسمحوا الجلوس لمدة 15 دقيقة في غطاء تدفق (الشكل 5).
- نقل 200 مل من Hyclone SFX مستنبت في نظيفة، معقمة 1،000 مل شاكر قارورة (بدون اقصائيات، مختومة مع رقائق الألومنيوم قبل التعقيم، لم يكن ينبغي استخدامها لالثقافات البكتيرية من قبل).
- نقل تعليق P3/cell في قارورة شاكر. ختم مع رقائق الألومنيوم العقيمة ونقل إلى قارورة شاكر. يهز في 70 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية لمدة 72-96 ساعة.
- حصاد البروتين المؤتلف من ارتفاع خمسة supernatants التعبير الخلية
- 72-96 ساعة العدوى آخر نقل supernatants الثقافة في 500 مل الدلاء الطرد المركزي. تدور في 5،500 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. في هذه الأثناء شطف قوارير شاكر 3x أخرى مع الماء المقطر مزدوجة([ده 2 O).
- نقل 3 مل ني الراتنج الطين في أنبوب 50 مل مع 45 مل من برنامج تلفزيوني (احد في حاجة لكل 200 مل الثقافة). يهز جيدا وتدور في 3،000 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. صب PBS والحفاظ على بيليه. مزيج طاف الخلية الحشرات مع بيليه ني الراتنج ونقل إلى قوارير شاكر تشطف بالفعل. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة، في حين تهز (الشكل 6).
- جبل 10 مل العمود البولي بروبلين على المشبك على موقف الدعم. إزالة كل القبعات ووضع كوب أسفل عمود لجمع التدفق من خلال (النفايات). أخذ قارورة شاكر من شاكر والبدء في نقل الخليط طاف / الطين على العمود، وسوف تحتفظ ني الراتنج وسوف فقط طاف تتدفق من خلال. تمرير وحدة التخزين بالكامل على العمود (الشكل 7).
- غسل 4x والراتنج مع 15 مل من غسل العازلة (50 ملي نا 2 HCO 3، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8). السماح لجميع استنزاف غسل العازلةمن العمود وإغلاقه مع غطاء (الجانب السفلي).
- إضافة 2 مل من شطف العازلة (50 ملي نا 2 HCO 3، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 300 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8) وترك الجلوس لمدة 5 دقائق. فتح العمود وجمع شطافة. كرر هذا 3 مرات أكثر (مع ما مجموعه 8 مل من شطف العازلة). شطافة الذي يحتوي على تركيزات عالية من البروتين يظهر عادة عندما اهتزت رغوة (الشكل 7). إبقاء شطافة على الجليد الرطب كلما أمكن ذلك.
- تبادل العازلة وتركيز
- (قد تتباين 30 كيلو دالتون وقف انتاج المواد الانشطارية للHA / لا أعرف ولكن اعتمادا على حجم البروتين النقي) Prespin 15 مل وحدات الطرد المركزي الفائق مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7،4-7،6) في 3000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تتدفق من خلال تجاهل وتحميل شطافة على عمود الدوران. ملء مع 5 مل من العقيمة، الجليد الباردة PBS وتدور لمدة 60 دقيقة في 3،000 XG في 4 درجات مئوية.
- تدفق من خلال التفريغ مرة أخرى، وإعادة ملء مع 15 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد وتدور لمدة 60 دقيقة في 3،000 XG في 4 درجات مئوية. كرر هذه اإلجراءاتملعرفة واحد مزيد من الوقت.
- اتخاذ عمود الدوران من أجهزة الطرد المركزي وجمع العازلة تبادل التركيز (عادة 200 ميكرولتر). ويتركز هذا البروتين المؤتلف للغاية. شطف عمود الدوران مع 400 ميكرولتر من العقيمة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني وإضافة إلى هذا التركيز. إبقاء التركيز على الجليد في جميع الأوقات.
3. توصيف ومراقبة الجودة
- قياس تركيز البروتين
اتخاذ قسامة من التركيز وقياسه باستخدام الأسلوب الكمي البروتين الخاص في الاختيار. تعيين تركيز البروتين إلى 1 ملغ / مل بإضافة برنامج تلفزيوني وتجميد مأخوذة الصغيرة إلى -80 درجة مئوية. دورات ذوبان الجليد تجميد تضر بنية البروتين ويمكن أن يؤدي إلى التجميع. - SDS-PAGE وتلطيخ Coomassie
تشغيل 500 نانوغرام من البروتين الخاص بك على SDS-PAGE وإجراء تلطيخ Coomassie. لتلطيخ سريعة ومريحة استخدام Coomassie كاشف بالاشتراك مع بروتوكول الميكروويف. وعادة ما تظهر البروتينات HA في 64كيلو دالتون في حين أن البروتينات NA تشغيلها في حجم حوالي 56 كيلو دالتون (الأرقام 8A وباء). باستخدام بروتوكول صفها يجب أن لا نرى أي تدهور المنتجات. في حالة حدوث تدهور فإنه عادة ما يكون علامة على تلوث الخميرة / فطرية أثناء التعبير. في هذه الحالة كرر الإجراء وتأكد من أن تبقي كل شيء العقيمة. - لطخة غربية / ELISA
من أجل التحقق من هوية البروتين نوصي القيام به لطخة غربية أو ELISA مقايسة مع الأجسام المضادة المحددة. من الناحية المثالية، يتم تنفيذ المقايسات ELISA مع الأجسام المضادة التي تربط لالحواتم متعلق بتكوين جزئي (مثل الأجسام المضادة لمكافحة HA ساق 1). استخدام مثل هذه الأجسام المضادة للطي الصحيح من البروتين يمكن تأكيد (الشكل 8C). - قياس النشاط NA
ويمكن أيضا للطي الصحيح للNA الفيروسية يتحدد من خلال قياس النشاط NA. نوصي لأداء هذا الاختبار باستخدام المتاحة تجاريا فحص NA * STAR (فقط اتبع المبادئ التوجيهية المستخدم).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أعرب جزيئات HA من A/Shanghai/1/13 وA/Anhui/1/13 بشكل جيد مع غلة حوالي 20 ثقافة ملغم / لتر. أظهرت جزيئات NA كل سلالات مستويات التعبير معتدلة تتراوح بين 0.2 ملغم / لتر للثقافة A/Shanghai/1/13 إلى 0.7 ملغ / لتر بالنسبة للA/Anhui/1/13. كان كل الاستعدادات البروتين أربعة القليل جدا من دون شوائب (الأرقام 8A وباء) مع قد يجري من النقاء أعلى من الوافدين الجدد والتي يمكن تفسيرها من خلال مستوى التعبير. تم تحليل A/Shanghai/1/13 HA مزيد باستخدام ELISA مع تحييد على نطاق واسع ساق رد الفعل الإنسان ماب CR9114 23. هذا ماب يربط إلى حاتمة بتكوين حساسة في المجال ساق، ويستخدم هنا كما تحقيقا للطي الصحيح من هذا المجال. الضد يظهر جيدة الملزمة والتي تعطي الثقة بأن HA هو في الواقع مطوية بشكل صحيح (الشكل 8C). وأجري ELISA الثانية مع المضادة للH7 الماوس بولكلونل المصل لتأكيد هوية البروتين الحصول عليها من H7 المنشأ (الرقم 8D).
الشكل 1. تخطيطي من HA و NA بنيات التعبير. التعبير بناء لHA (A) يحتوي على إشارة الببتيد N-محطة تليها ectodomain HA، وهو موقع ثرومبين الانقسام، مجال T4 trimerization وعلامة hexahistidine. وبناء التعبير NA (B) يحتوي على إشارة الببتيد-N محطة تليها علامة hexahistidine وعائي تحفيز بروتين فسفوري؛ فسوبروتين (VASP) المجال tetramerization وectodomain NA. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. مخطط generat bacmidأيون (كما هو موضح في الخطوة 1.1.2). يتم تحويل ناقلات الفيروسة العصوية نقل تحتوي HA NA أو الجينات في البكتيريا DH10Bac. إعادة التركيب في الجينوم الفيروسة العصوية التي تحمل هذه البكتيريا تنتج النمط الظاهري مستعمرة بيضاء على لوحات مختارة. يتم اختيار مستعمرة بيضاء وrestreaked. ويستخدم مستعمرة واحدة من لوحة restreaked لتطعيم ثقافة midiprep.
الرقم 3. مخطط الإنقاذ الفيروسة العصوية والعمل الجيل الأسهم (كما هو موضح في الخطوات 1.2.1-6) مخففة. bacmid المؤتلف وكاشف ترنسفكأيشن في المصل خالية المتوسطة تنم-FH. يتم الجمع بين الحلين، وحضنت هذا المزيج لمدة 20 دقيقة، ثم نقل إلى خلايا Sf9. ست ساعات بعد ترنسفكأيشن يتم استبدال وسائل الإعلام ترنسفكأيشن من قبل وسائل الإعلام الكامل تنم-FH. ستة أيام بعد ترنسفكأيشن يتم حصاد طاف وبيليه الخلية هو الشرجyzed للتعبير عن البروتينات المؤتلف.
الشكل 4. الخلايا خلايا Sf9 صحية والمصابين. Sf9 في (A) يتمتعون بصحة جيدة وغير مصاب. أنها ملحقة الطبق الثقافة، تبدو متعددة الأشكال جزئيا والصغيرة نسبيا. والخلايا المصابة في (B) مع الفيروسة العصوية، بعيدة عن صحن الثقافة، هي كبيرة ومستديرة، ولقد وسع نوى. يظهر النواة أيضا ظهور حبيبات.
الرقم 5. إصابة ارتفاع خمسة الخلايا مع الفيروسة العصوية المؤتلف (الأسهم العمل، كما هو موضح في الخطوة 2.2). يتم حصاد خمس قوارير متكدسة T175 مع خمسة خلايا عالية من خلال السرعة المنخفضة الطرد المركزي وجنبا إلى جنب مع 15 مل من P3 الفيروسة العصوية الأسهم. بعد 15 دقيقة من فيcubation يتم نقل الخليط خلية / مل الفيروس إلى 1،000 قوارير شاكر مع 200 مل من وسائل الإعلام SFX.
الرقم 6. حصاد الخلايا طاف 72-96 عدوى آخر ساعة والحضانة مع الراتنج ني NTA (كما هو موضح في الخطوة 2.3). يتم حصاد الايقاف الخلية المصابة عن طريق انخفاض سرعة الطرد المركزي. يتم خلط supernatants ثقافة مع برنامج تلفزيوني معايرتها ني الراتنج وحضنت لمدة 2-4 ساعة في حين تهتز.
الرقم 7. الإجراء تنقية (على النحو المبين في 2.3 و 2.4) ومراقبة الجودة (كما موضح في الخطوات 3.1.1-4). بعد مرور فترة الحضانة للجميع من خليط طاف / الراتنج يتم تحميل على أعمدة البولي بروبلين. يتم الاحتفاظ الراتنج من الأعمدة ومن ثم يتم غسلها أربع مرات مع غسل BUFومزال فر والبروتين المؤتلف مع 8 مل من شطف العازلة تطبيقها في 2 مل الخطوات. شطافة ثم يتم تبادل العازلة وتتركز مع عمود الدوران الفائق، aliquoted والمجمدة. وتشمل فحوصات مراقبة الجودة SDS-PAGE، البقعة الغربية، ELISA وقياس النشاط NA NA المؤتلف.
الرقم 8. وقد تم تحليل نتائج ممثل. HA (A) و NA (B) من البروتينات A/Anhui/1/13 وA/Shanghai/1/13 باستخدام SDS-PAGE وتلطيخ Coomassie. تم تقييم السلامة الهيكلية للHA من A/Shanghai/1/13 باستخدام تحييد على نطاق واسع ساق رد الفعل الإنسان الضد CR9114 التي تربط لحاتمة بتكوين الحساسة (C). تم تأكيد هوية من نفس HA قبل بولكلونل مكافحة H7 الماوس المصل (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن التعبير عن فيروس الأنفلونزا HA و NA البروتينات في خلايا الحشرات باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية عموما على التوالي إلى الأمام، وهناك العديد من النقاط الهامة للنظر فيها. من المهم، كما أشار في المقدمة، أن يتم التعبير عن ectodomains من HA و NA في الانصهار مع trimerization أو tetramerization المجالات، على التوالي. هذه المجالات ضمان للطي الصحيح من الجزيئات بمساعدة عادة من قبل المجال عبر الغشاء، وهي ليست موجودة إذا ما يعبر عنه فقط ectodomain. على سبيل المثال، للتعبير عن ectodomain HA دون مجال trimerization يؤدي إلى زعزعة الاستقرار في oligomerization والحواتم تحييد هاما في المجال ساق 1. علاوة على ذلك، انخفض الاستقرار من البروتينات والتحلل بواسطة خلية الحشرات والبروتياز الفيروسة العصوية يحدث. اختيار trimerization أو tetramerization المجال هو أقل أهمية، وعدد منهم بدءا من المجالات يسين سحاب 22لT4 foldons فج تم اختبار 11 حتى الآن، وأظهرت جميع نتائج مرضية. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن المواقع الانقسام multibasic كما تحدث في الفيروس H5N1 الشديد الإمراض 24 أو 25 عزلات H7N7 (ولكن ليس في H7N9) يجب ازالتها قبل التعبير لأنها المشقوق بواسطة فورين مثل البروتياز التي هي موجودة في جميع الأوقات نظام التعبير الفيروسة العصوية 1،12.
آخر الأسباب المحتملة لمنتجات degradational هو التلوث مع الخميرة أو العفن. هذا يمكن أن يحدث في وقت مبكر من خلال العمل الجيل الأسهم ويمكن أن تذهب دون أن يلاحظها أحد خلال تخزين الأسهم في 4 درجات مئوية. العديد من الخمائر والعفن تفضل درجات حرارة تتراوح بين 20-30 درجة مئوية للنمو الأمثل ويتم تثبيط الواقع عند 37 درجة مئوية، وهي درجة حرارة ثقافة مشتركة لخلايا الثدييات. لأن معظم المضادات الحيوية التي تستخدم في زراعة الخلايا ليست فعالة ضد الكائنات حقيقية النواة مثل الخميرة والعفن، وزراعة الخلايا الحشرات هو performe د في ظروف النمو المثلى من هذه الجراثيم الحذر يجب أن يؤخذ في جو معقم و مطهر حيث التعامل مع الثقافات. بالإضافة إلى زيادة في النمو خلايا الحشرات والمحمضة وسائل الإعلام، وقوالب والخمائر التعبير عن العديد من البروتياز القابلة للذوبان، وبالتالي يمكن أن تتحلل تماما البروتينات المؤتلف.
والمشكلة التي تحدث في بعض الأحيان هو هطول الأمطار في شطف العازلة. نادرا ما يشاهد هذا وأكثر أو أقل تحديدا سلالة (على سبيل المثال A/Vietnam/1203/04 H5 HA يميل إلى يعجل)، ولكن يمكن الوقاية منها عن طريق الصرف السريع والكامل عازلة لبرنامج تلفزيوني. لا ينصح تخزين البروتينات في المحتوية على إيميدازول شطف العازلة. يجب أن يتم تنفيذ الإجراء تنقية من الحصاد لتجميد مأخوذة إلى -80 درجة مئوية في غضون ينبغي تجنبها يوم عمل واحد وتخزين البروتين النقي في درجة حرارة غير -80 ° C. أيضا، وقد ثبت تكرار تجميد أذاب دورات للتأثير سلبا على استقرار بعض الحواتم 1.
_content "> ينبغي أن يتوقع أن يكون العائد في حدود 0،2 حتي 30 ملغ / لتر الثقافة. عديدة في التعبير عن النطاق العلوي بينما تميل الوافدين الجدد للتعبير على مستويات أدنى. أيضا، ومستويات التعبير لديه ويبدو أن ترتبط عكسيا مع عدد مواقع ارتباط بالغليكوزيل. تمت من H3N2 البشرية الموسمية والموسمية H1N1 prepandemic يعزل عادة ما تظهر مستويات التعبير منخفضة، في حين أن معظم ديه من أصل فيروس انفلونزا الطيور لديهم مستويات عالية التعبير. لتحسين التعبير فمن المستحسن لزيادة كثافة الخلايا في قارورة أو لمحاولة لاستخدام كميات أقل أو أكثر الاسهم عمل في التعبير. زيادة 10 أضعاف أو نقصان من المخزون العمل يمكن أن تؤثر إيجابا على مستويات التعبير. ومن العوامل الأخرى التي يمكن أن تؤثر على مستويات التعبير هي المرة بين العدوى والحصاد. 96 ساعة تعتبر مثالية بالنسبة لمعظم لديها و لكن الوافدين الجدد مرات الحضانة أقصر قد تزيد في الواقع غلة بعض البروتينات.خلايا الحشرات هي قادرة على أداء تعديلات ما بعد النقل في الثدييات تقريبامثل ن بطريقة وقادرون على أضعاف هياكل البروتين معقدة جدا مع كفاءات مماثلة لخلايا الثدييات (ولكن إنتاج عائدات أعلى). من حيث ارتباط بالغليكوزيل، فإنها تظهر نمطا مختلفا قليلا من خلايا الثدييات ويتميز معظمها paucimannosidic N-glycans التي تفتقر تعديلات الحامض اللعابي 19. ومع ذلك، خطوط الخلايا الحشرات التي تم تعديلها لإنتاج الثدييات مثل ارتباط بالغليكوزيل (بما في ذلك الحامض اللعابي محطة) متاحة تجاريا 14.
نظام التعبير الفيروسة العصوية هو أداة مفيدة للغاية للتعبير عن المؤتلف بروتينات سكرية سطح الأنفلونزا - HA و NA. وتستخدم هذه البروتينات المؤتلف للعديد من المقايسات المناعية والكيمياء الحيوية، وكذلك لتوحيد المحتويات مستضد اللقاحات وكما المستضد للتجارب التطعيم في نماذج حيوانية. أعرب الفيروسة العصوية-HA و NA تظهر الوظيفة البيولوجية كاملة وقابلة للطي الصحيح إذا أعرب في الإطار مع trimerizatiوعلى المجالات tetramerization على التوالي. هذا تميزها عن البكتيريا قد أعرب التي هي غير الغليكوزيلاتي وتفتقر الحواتم وظيفية في المجال ساق. وعلاوة على ذلك، فإن المعروضات نظام التعبير الفيروسة العصوية غلة البروتين أعلى بكثير من نظم خلايا الثدييات 26 والمناولة ورفع مستوى أسهل. في ملخص وصفنا بروتوكول سهلة وفعالة للتعبير عن كميات كبيرة من فيروس الانفلونزا المؤتلف HA و NA الجزيئات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر باتريك ويلسون لريتوكسيماب CR9114. نشكر أيضا جنيفر Debeauchamp وريتشارد ويبي لالبلازميدات A/Anhui/1/13 الأصلي. تم تقديم الدعم الجزئي لهذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التي تمولها مشروع برنامج منح AI097092-01A1 وCEIRS (مراكز التميز للبحوث الأنفلونزا ومراقبة، HHSN26620070010C). وأيد FK من قبل اروين شرودنجر الزمالة (J 3232) من صندوق العلوم النمساوية (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
