Summary
Her beskriver vi en måte å uttrykke korrekt foldet og funksjonelle influensavirus overflateantigener avledet fra romanen kinesiske H7N9-viruset i insektceller. Teknikken kan tilpasses til å uttrykke ectodomains av noen virale eller cellulære overflateproteiner.
Abstract
The baculovirus expression system er et kraftig verktøy for ekspresjon av rekombinante proteiner. Her bruker vi den til å produsere riktig foldet og glykosylert versjoner av influensa A virus overflate glykoproteiner - hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA). Som et eksempel, vi valgte HA og NA proteiner uttrykt av romanen H7N9-viruset som nylig dukket opp i Kina. Men protokollen kan enkelt tilpasses for HA og NA proteiner uttrykt av noen annen influensa A og B virusstammer. Rekombinant HA (rHA) og NA-(RNA) proteiner er viktige reagenser for immunologiske analyser som ELISPOT-og ELISA, og er også i utstrakt bruk for vaksine standardisering, antistoff oppdagelse, isolering og karakterisering. Videre kan rekombinante NA-molekyler anvendes for screening av små molekyl-inhibitorer og er nyttige for karakterisering av den enzymatiske funksjon av NA, så vel som dens følsomhet overfor antivirale midler. Rekombinante HA proteiner er også being testet som vaksiner i dyremodeller, og en vaksine basert på rekombinant HA ble nylig godkjent av FDA for bruk i mennesker. Metoden som beskrives her for å produsere disse molekylene er rett frem og kan lette forskning i influensa laboratorier, siden den gjør det mulig for produksjon av store mengder av proteiner raskt og til en lav kostnad. Selv om vi her fokuserer på influensavirus overflate glykoproteiner, kan denne metoden også brukes til å produsere andre viral og cellulære overflateproteiner.
Introduction
Som en første reaksjon på den siste fremveksten av det nye H7N9 influensavirus stamme i Kina, vi ervervet plasmider som bærer de genomiske sekvenser for hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) gener i de to første isolater. Ved hjelp av disse plasmider var vi i stand til raskt å konstruere baculoviral ekspresjonsvektorer for produksjon av rekombinante HA-og NA i insektceller. Dette uttrykket systemet er godt etablert i vårt laboratorium og har vist seg avgjørende for mange av våre pågående forskningsprosjekter 1-8. Insektceller er i stand til å fullstendig brette-og post-translasjonelt modifisere komplekse proteiner. Disse modifikasjoner inkluderer N-bundet glykosylering, noe som er viktig for mange virus-glykoproteiner. Som sådan, er det ikke overraskende at baculovirus-systemet er helt etablert for å uttrykke influensavirus overflateantigener. Faktisk har mange av HA-og NA-krystallstrukturer blitt løst ved hjelp av insektceller uttrykte proteiner 9-11. En annen fordel med densystemet ligger i sin pålitelige høy proteinutbytter på opp til 30 mg av HA / L cellekultur (basert på vår erfaring med mer enn 50 forskjellige HA proteiner) - en konsekvens av virus-infeksjon drevet uttrykk fra den sterke polyhedrinpromotor.
Fjerning av det transmembrane og endodomain av HA-og NA-proteiner tillater ekspresjon av utskillbare, oppløselige versjoner av proteinene og dermed i stor grad letter renseprosessen. I tillegg er disse ectodomains hexahistidine merket og kan derfor bli renset ved anvendelse av affinitetskromatografi ved hjelp av Ni 2 +-harpiks. De transmembrane domener av HA og NA proteiner bidra til homotrimer og homotetramer formasjon, henholdsvis. For å bevare disse oligomerizations, legger vi en C-terminal domene til trimeriserings HA-og en N-terminal tetramerization domenet til NA konstruerer (figur 1). Vi har bevist at en slik Trimeriserdomene stabiliserer funksjonell, konserved conformational epitoper på stilken-domenet til HA en. Den korrekte tetramerization av NA kan også bidra til å korrigere folding og NA-funksjon 10. Følger og baculo-overføring vektorer trimeri eller tetramerization domener kan bli bedt om fra forfatterne eller fra andre laboratorier i feltet, 9,10,12.
En annen viktig sak for ekspresjon av utskilte proteiner i insektceller er valget av den riktige cellelinje. Mens Spodoptera frugiperda avledet Sf9 celler støtte baculovirus replikering veldig godt og er vanligvis brukt for virus redning og forplantning, har de begrenset kapasitet til å skille store mengder protein. Trichoplusia ni avledet BTI-TN-5B1-4 celler (kjent som High Five) ha en høyere kapasitet og sekresjon er cellelinjen grepet av ekspresjon i denne protokollen 13,14. Videre er det nyttig til å redusere eller til og med fjerne føtalt bovint serum (FBS) fra uttrykket kulturer. Vi bruker derfor media med redusert (3%) FBS innhold for voksende virusarbeids aksjer, og vi utfører protein uttrykk i serum frie medier.
Rekombinante HA-og NA-proteiner blir brukt i mange immunologiske teknikker. Kanskje den mest vanlige er i ELISA-analyser for å måle serum konvertering ved vaksinering hos mennesker eller dyr 4,6,7,15. Har og NAs brukes også i ELISPOT analyser som både stimulerende molekyler og påvisningsreagenser for antistoff sekresjonsceller 16. Deres anvendelse som molekylære agn gjør det mulig å spesifikt sortere for plasmablasts eller andre typer av B-celler som deretter kan brukes for å isolere (terapeutiske) monoklonale antistoffer (mAbs). Rekombinante HA-og NA-molekyler blir videre brukt til karakteriseringen av disse mAbs 8. Andre eksempler inkluderer studere pH stabilitet eller reseptor spesifisitet har uttrykt ved ulike virusisolatene, eller kvantitativt vurdere konkrete NA enzymatiskaktivitet eller motstand mot hemmere. Videre rekombinant, renset HA kan anvendes for å standardisere innholdet av HA inaktiv influensavirus-vaksiner.
Viktigere, rHA (og til en viss grad NA) vaksinekandidater er under utprøving i dyremodeller og kliniske studier med en vaksine kandidat blir lisensiert av FDA i 2013 2,17-19. Fordelen med disse nye vaksiner er at, på grunn av det rekombinante natur av disse proteinene, kan en arbeidskrevende prosess med generering av høye vekst reassorterte virus unngås. Kanskje enda mer relevant er det faktum at deres HA avkastning er høy og reproduserbar fra belastning til belastning. Også, siden disse vaksiner er produsert i en egg-fritt system, at de ikke inneholder protein-forurensninger som er problematiske for personer med allergier egg.
Her valgte vi å uttrykke HA og NA proteiner fra to isolater av romanen kinesisk H7N9 influensavirus, A / Anhui/1/13 og A/Shanghai/1/13 20,21. Disse er rettidig eksempler, men den beskrevne protokoll kan anvendes for ekspresjon av hvilken som helst av influensa A og B HA eller NA-proteiner, og kan være tilpasset til å uttrykke andre utskilling av virale eller cellulære proteiner. Trimere eller tetramer transmembrane proteiner kan bli klonet inn i ekspresjonskassetter som brukes for HA-og NA, respektivt. Men de fleste løselige utskilling av cellulære proteiner, som interferoner for eksempel, trenger ikke en ekstra domene for stabilisering og kan uttrykkes utelukkende med en C-terminal hexahistidine tag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Generering av rekombinant Baculovirus
- Kloning inn baculovirus transfer-plasmider
- Clone H7 HA og N9 NA ektodomenet (eller hvilken som helst annen HA eller NA-genet) i modifiserte pFastBac overføre plasmider (se innledningen). Vektorer for HA inneholdende en C-terminal trimeriseringsdomenet og en hexahistidine tag, samt for NA inneholdende et N-terminalt domene tetramerization og hexahistidine tag, er blitt beskrevet 1,10,11,22 (fig. 1) og kan forespørres fra forfatterne.
Forklaring: HA ectodomains uttrykt uten Trimeriser domenet vil bli kastet på feil måte, noe som fører til tap av konformasjonsendringer nøytraliserende epitoper, spesielt i stilken domenet. Tilsvarende, stoler NA enzymatisk funksjon på riktig tetramerization. - Generering av bacmids
Transform baculovirus transfer-plasmider som inneholder HA og NA-gener i DH10Bac bakterier henhold ved hjelp av en baculovirus uttrykksystem i henhold til produsentens instruksjoner. Isolere og rense bacmids bruker en Midiprep kit i henhold til produsentens instruksjoner (figur 2).
- Clone H7 HA og N9 NA ektodomenet (eller hvilken som helst annen HA eller NA-genet) i modifiserte pFastBac overføre plasmider (se innledningen). Vektorer for HA inneholdende en C-terminal trimeriseringsdomenet og en hexahistidine tag, samt for NA inneholdende et N-terminalt domene tetramerization og hexahistidine tag, er blitt beskrevet 1,10,11,22 (fig. 1) og kan forespørres fra forfatterne.
- Redning av rekombinant baculovirus og verifikasjon av protein uttrykk
Forklaring: Følgende tiltak må utføres aseptisk i en laminær hette. Dette utfører uavhengig for HA-og NA (eller hvilken som helst annen genet av interesse). Insektceller blir vanligvis dyrket ved 28 ° C uten CO2. Sf9-celler for denne protokollen blir dyrket i sin helhet TNM-FH insektcellemateriale supplert med 10% FBS, 1% Pen-Strep * og 0,1% Pluronic F68 løsning, hvis ikke annet er angitt, og passaged 1:04 to ganger i uken. High Five celler dyrkes i SFX serum frie medier og passaged 01:15 to ganger i uken.
* Tilsetning av antibiotika skal betraktes som valgfritt gjennom protokoll og justeres i henhold til de fremgangsmåter som brukes i hver laboratorium.- Plate Sf9 insektceller i 6-brønns plater ved en densitet på 2 x 10 5 celler / cm 2, og lar stå i 20 min i en 28 ° C inkubator (uten CO2).
- Bland 2 pg (kons. 0,5 til 2 ug / ul) av rekombinant bacmid med 100 mL av TNM-FH-medium (serumfritt, 1% Pen-Strep). Bland 6 mL av transfeksjon agent med 100 mL av TNM-FH medium (serum gratis, Pen-Strep). Kombiner de to bindene, bland forsiktig og la sitte i 20 minutter ved romtemperatur (transfeksjon blanding). Inkluder en mock-transfeksjon som kontroll (figur 3).
- Fjern supernatanten fra belagt Sf9 celler (celler vil nå holde seg til plate) og erstatte med 2 ml serum gratis TNM-FH medium som inneholder Pen-streptokokk (1%). Tilsett fullstendige volumet til transfeksjon blandingen (punkt 1.2.2) og rock 6-brønns plate forsiktig i 5 sek. Inkuber i en 28 ° C inkubator uten CO2 i 6 timer (figur 3).
- Bytt media with ferske fulle TNM-FH media (som inneholder 10% FBS, 1% Pen-Strep og 0,1% Pluronic F68). Inkuber i en 28 ° C inkubator uten CO 2 for 6 dager. Sjekk celler tidvis under et mikroskop. Infiserte celler vanligvis vises større, rundere, har forstørret kjerner, og begynner å løsne (figur 4).
- Innhøsting av celler og bekreftelse av proteinekspresjon
- Slakte celler 6 dager etter transfeksjon ved sentrifugering ved 2000 xg i 5 min ved romtemperatur. Supernatanten inneholder det rekombinante baculovirus - dette vil bli brukt til å generere arbeids bestander med en gang, eller kan bli lagret ved 4 ° C i mange år.
- For å sjekke protein uttrykk samle pellets og resuspender i 500 mL PBS. Bland 50 ul av suspensjonen med 50 ul SDS-PAGE loading buffer (inneholdende et reduksjonsmiddel). Løpe SDS-PAGE og utføre en Western blot-analyse med et anti-hexahistidine antistoff for å bekrefte genekspresjon. Inkluder celler fra mocktransfeksjon som negative kontroller (figur 3).
- Utarbeidelse av arbeids aksjer
- Plate 5 x 10 5 Sf9 celler / cm 2 i en T175 cm 2 kolbe og la sitte i 20 min tillate dem å feste til parabolen. Skift ut komplett TNM-FH media med TNM-FH media som inneholder 3% FBS (og 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Infect cellene med 100 ul av rednings supernatant. Inkuber i en 28 ° C inkubator uten CO 2 for seks dager og se jevnlig hvis cellene bli infisert (som beskrevet i trinn 1.2.5.).
- Spin ved 2000 xg ved romtemperatur i 5 min, og samle supernatanten. Dette er nå din P2 lager. Dette lager kan lagres på ubestemt tid ved 4 ° C. Gjenta infeksjonen prosedyren ved hjelp av 100 mL av P2 lager å infisere celler. Den resulterende lager kalles P3 eller arbeider lager, som kan lagres ved 4 ° C eller anvendt direkte for proteinekspresjon. P3 lager inneholder vanligvis 10 <sup> 7 -10 9 plakk forming units / ml.
2. Protein Expression og rensing
Forklaring: Sf9 celler støtte veksten av baculovirus veldig godt. Imidlertid er deres evne til å utskille store mengder av rekombinant protein begrenset. Derfor bruker vi en insektcellelinje, High Five celler for ekspresjon av utskilling av rekombinante proteiner. Disse cellene støtter ikke baculovirus replikering til svært høye titere 13, men har høy sekretorisk kapasitet.
- Oppveksten high five celler
Grow high five celler i SFX insekt cellekulturmedium i T175 cm 2 kolber. Passage annenhver dag 01:03. For en 200 ml uttrykk kultur vil du trenger for å vokse fem konfluente kolber. - Høsting og infisere high five celler
- Løsne high five celler fra fem T175 cm 2 kolber ved å tappe flaskene med hånden. Samle cellen suspension og overfør til 50 ml sentrifuge rør.
- Spin ved 1200 x g i 7 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten ved dekantering, og forene de pellets ved å oppslemme dem i 15 ml P3 lager.
- La stå i 15 min i strømningshette (figur 5).
- Overfør 200 ml Hyclone SFX kulturmedium inn i en ren, steril 1 000 ml ristekolbe (uten ledeplater, forseglet med aluminiumsfolie før autoklavering, ikke skulle ha vært brukt til bakteriekulturer før).
- Overfør P3/cell suspensjonen i shaker kolbe. Tett med folie steril aluminium og overføring kolbe i en shaker. Rist ved 70 rpm ved 28 ° C i 72-96 timer.
- Høsting rekombinant protein fra High Five celle uttrykk supernatanter
- 72-96 hr innlegg infeksjon overføre dyrkningssupernatanter inn 500 ml sentrifuge bøtter. Spin ved 5500 xg i 20 min ved 4 ° C. I mellomtiden skyll rystekolber 3x med dobbelt destillert vann(DDH 2 O).
- Overføring 3 ml Ni-resin slurryen inn i et 50 ml rør med 45 ml PBS (en nødvendig per 200 ml kultur). Ryst godt og rotere ved 3000 x g ved romtemperatur i 10 min. Dekanter PBS og holde pelleten. Bland insekt celle supernatanten med Ni-harpiks pellet og overføre til de allerede skylt rystekolber. Inkuber ved 4 ° C i 2-4 timer, mens risting (figur 6).
- Mount 10 ml polypropylen kolonne på en klemme på en støttefoten. Fjern både caps og plassere et beger under kolonnen for å samle flyt gjennom (avfall). Ta ristekolbe ut av rister og begynne å overføre den overliggende væske / slurry blandingen på en kolonne, det vil beholde Ni-harpiks og bare supernatanten vil strømme gjennom. Før hele volumet over-kolonne (figur 7).
- Vask harpiksen 4x med 15 ml vaskebuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8). La all den vaskebuffer avløpetfra kolonnen og lukke den med lokket (underside).
- Tilsett 2 ml elusjons-buffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 8) og la det stå i 5 min. Åpne kolonne og samle eluatet. Gjenta dette 3 ganger (med totalt 8 ml elusjons-buffer). Eluatet som inneholder høye konsentrasjoner av protein viser typisk skum når den ristes (figur 7). Hold eluatet på våt is når det er mulig.
- Buffer utveksling og konsentrasjon
- Prespin 15 ml ultrafiltrasjon sentrifugeringsenhetene (30 kDa Tids for HA / NA, men kan variere avhengig av det rensede protein størrelse) med PBS (pH 7,4 til 7,6) ved 3000 x g ved 4 ° C i 20 min. Kast strømme gjennom og last eluatet på spin kolonnen. Fyll opp med 5 ml steril iskald PBS og sentrifugering i 60 min ved 3000 x g ved 4 ° C.
- Utladnings strømning gjennom på nytt, etterfyller med 15 ml iskald PBS og sentrifugering i 60 minutter ved 3000 xg ved 4 ° C. Gjenta denne prosedure en gang til.
- Ta spinnkolonne ut av sentrifugen og samle buffer utvekslet konsentrat (typisk 200 ul). Dette er svært konsentrert rekombinant protein. Skyll spin-kolonnen med 400 mikroliter sterilt iskald PBS og tilsett dette til konsentratet. Hold konsentrat på is til alle tider.
Tre. Karakterisering og kvalitetskontroll
- Måling av proteinkonsentrasjonen
Ta en prøve av konsentratet og måle den ved hjelp av protein kvantifisering metode for valg. Sett proteinkonsentrasjon på 1 mg / ml ved tilsetning av PBS, og fryse små alikvoter til -80 ° C. Frys tinesykluser skade proteinstrukturen og kan føre til aggregering. - SDS-PAGE og Coomassie farging
Kjør 500 ng av protein på en SDS-PAGE og utføre en Coomassie farging. For rask og praktisk farging bruke Coomassie reagens i kombinasjon med en mikrobølgeovn protokoll. HA proteiner vanligvis vises på 64kDa, mens NA-proteiner bør drives med en størrelse på rundt 56 kDa (figur 8A og B). Ved hjelp av den beskrevne protokollen bør du ikke se noen degraderingsprodukter. Ved nedbrytning oppstår det vanligvis et tegn på gjær / soppforurensning under ekspresjon. I dette tilfellet gjenta prosedyren og sørge for å holde alt sterilt. - Western blot / ELISA
For å verifisere identiteten protein anbefales det å gjøre en Western blot-eller ELISA-analyse med et spesifikt antistoff. Ideelt sett er ELISA-analyser utført med et antistoff som binder seg til konformasjonsforandringer epitoper (f.eks anti-HA-antistoffer stilken 1). Ved hjelp av et slikt antistoff korrekt folding av proteinet kan bli bekreftet (figur 8C). - Måling NA aktivitet
Riktig folding av viral NA kan også bestemmes ved måling av IR-aktivitet. Vi anbefaler å utføre denne testen bruker kommersielt tilgjengelige NA * STAR analysen (bare følge retningslinjene bruker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA molekyler fra A/Shanghai/1/13 og A/Anhui/1/13 uttrykt godt med avkastning på ca 20 mg / L kultur. NA molekyler av begge stammer viste moderate uttrykk nivåer som spenner fra 0,2 mg / L kultur for A/Shanghai/1/13 til 0,7 mg / L for A/Anhui/1/13. Alle fire proteinpreparater hadde svært liten eller ingen urenheter (Tall 8A og B) med har blir av høyere renhet enn NAs som kan forklares av uttrykket nivå. A/Shanghai/1/13 HA ble analysert videre med ELISA med bredt nøytraliserende stengel-reaktivt menneskelig MAB CR9114 23. Dette mAb binder seg til en epitop følsom konformasjonsendring i stilken domenet og blir her brukt som en sonde for korrekt folding av dette domenet. Antistoffet viser god binding som gir tillit til at HA er faktisk brettes riktig (figur 8C). En andre ELISA med anti-H7 mus polyklonalt serum ble utført for å bekrefte identiteten til den oppnådde protein pr H7 opprinnelse (Figur 8D).
Figur 1. Skjematisk av HA og NA ekspresjonskonstruksjoner. Utrykket konstruere for HAet (A) inneholder en N-terminal signal-peptid etterfulgt av HAet ektodomenet, en trombin spaltningssetet, en T4 trimeriseringsdomenet og en hexahistidine signal. NA uttrykk konstruere (B) inneholder en N-terminal signal peptid etterfulgt av en hexahistidine tag, en vasodilator stimulerende fosfoprotein (VASP) tetramerization domenet og NA ektodomenet. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Scheme av bacmid genererion (som beskrevet i trinn 1.1.2). A baculovirus-overføringsvektor inneholdende HA-eller NA gener transformeres i DH10Bac bakterier. Rekombinasjon inn baculovirus genomet at disse bakteriene bære produserer en hvit koloni fenotype om seleksjonsplater. En hvit koloni er plukket og restreaked. En enkelt koloni fra restreaked platen blir brukt til å inokulere en midiprep kultur.
Figur 3. Scheme of baculovirus rednings-og arbeidslager generasjon (som beskrevet i trinn 1.2.1-6). Rekombinant bacmid-og transfeksjon reagens blir fortynnet i serumfritt TNM-FH-medium. De to oppløsninger kombineres, blandingen inkuberes i 20 min og deretter overført på Sf9-celler. Seks timer etter transfeksjon transfeksjon media er erstattet av fulle TNM-FH media. Seks dager etter transfeksjon supernatanten høstet og cellepelleten er analyzed for uttrykk av rekombinante proteiner.
Figur 4. Sunn og infiserte Sf9 celler. Sf9 celler i (A) er friske og infisert. De er festet til dyrkningsskål, let delvis polymorfe og relativt liten. Celler i (B) er infisert med baculovirus, løsnet fra dyrkningsskål, er store og runde og har forstørret kjerner. Kjernen viser også et granulært utseende.
Figur 5. Infeksjon av high five celler med rekombinant baculovirus (arbeids lager, slik det er beskrevet i trinn 2.2). Five konfluente T175 kolber med high five celler høstes ved lav hastighet sentrifugering og kombinert med 15 ml av P3 baculovirus lager. Etter 15 minutter av icubation celle / virusblandingen overført til 1000 ml rystekolber med 200 ml SFX media.
Figur 6. Høsting av celler supernatant 72-96 timer etter infeksjon og inkubering med Ni-NTA-harpiks (som beskrevet i trinn 2.3). Infiserte cellesuspensjoner blir høstet ved sentrifugering med lav hastighet. Kultursupernatanter blandet med PBS-ekvilibrert Ni-harpiks og inkubert i 2-4 timer mens risting.
Figur 7. Rensing prosedyre (som beskrevet i 2.3 og 2.4), og kvalitetskontrollen (som beskrevet i trinn 3.1.1-4). Etter inkubering i all supernatant / harpiksblandingen er lastet på polypropylen-kolonner. Harpiksen blir holdt tilbake i kolonnene, og vaskes deretter fire ganger med vaske buffer, og det rekombinante protein elueres med 8 ml av elueringsbufferen anvendt i to trinn ml. Eluatet blir deretter buffer utvekslet og konsentrert med en ultrafiltrerings spinn kolonne, alikvotert og frosset. Kvalitetskontroll-analyser inkluderer SDS-PAGE, Western Blot, ELISA og ved måling av aktiviteten til rekombinant NA NA.
Figur 8. Representative resultater. HA (A) og Na (B) proteiner av A/Anhui/1/13 og A/Shanghai/1/13 ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og Coomassie farging. Strukturell integritet av HA av A/Shanghai/1/13 ble vurdert ved hjelp av bredt nøytraliserende menneskelig stilk-reaktivt antistoff CR9114 som binder seg til et følsomt conformational epitop (C). Identiteten til den samme HA ble bekreftet av et polyklonalt anti-H7 museserum (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om ekspresjonen av influensavirus-HA-og NA-proteiner i insektceller ved hjelp av baculovirus ekspresjonssystem er generelt rett frem, er det flere viktige punkter for å vurdere. Det er viktig, som påpekt i innledningen, at ectodomains av HA-og NA er uttrykt i fusjon med trimeriserings eller tetramerization domener, respektivt. Disse domenene sikre korrekt folding av molekylene vanligvis assistert av den transmembrane domene, som ikke er tilstede hvis bare ektodomenet uttrykkes. For eksempel er ekspresjon av HA ektodomenet uten en trimeriserings domene fører til oligomerisering og destabilisering av viktige nøytraliserende epitoper i stilken domene 1.. Videre er stabiliteten av proteinene ble redusert, og nedbrytningen av insektceller og baculovirus-proteaser inntreffer. Valget av trimeriserings eller tetramerization domene er mindre viktig, en rekke av dem strekker seg fra leucin glidelås domener 22til T4 fagplakker foldons 11 har blitt testet så langt, og alle viste tilfredsstillende resultater. Det er viktig å huske på at multibasic spaltningsseter som de oppstår i høypatogen H5N1 24 eller H7N7 25 isolater (men ikke i H7N9) må fjernes før uttrykket siden de er spaltet av Furin som proteaser som er til stede hele tiden i baculovirus uttrykk system 1,12.
En annen mulig årsak til degradational produkter er forurensning med gjær eller mold. Dette kan skje så tidlig som i arbeidslager generasjon og kan gå ubemerket under lagring av bestanden ved 4 ° C. Mange gjærsopper og muggsopper foretrekker temperaturer mellom 20-30 ° C for optimal vekst, og faktisk er hemmet ved 37 ° C, noe som er vanlig kulturtemperaturen for pattedyrceller. Siden de fleste antibiotika som brukes i cellekultur er ikke effektiv mot eukaryote organismer som gjær og mugg, og insektcellekultur er performe d ved optimale vekstforhold for disse bakteriene ekstra omsorg har å bli tatt i form av aseptisk håndtering av kulturer. I tillegg til gjengroing insektceller og surgjøring media, muggsopp og gjærsopp uttrykker mange oppløselige proteaser og kan derfor fullstendig nedbrytes rekombinante proteiner.
Et problem som ofte oppstår er utfelling i elueringsbufferen. Dette er sjelden og mer eller mindre belastning bestemt (f.eks A/Vietnam/1203/04 H5 HA har en tendens til å utfelle), men kan forhindres ved rask og fullstendig bufferutveksling til PBS. Lagring av proteinene i imidazol-holdig elueringsbufferen er ikke anbefalt. Rensefremgangsmåten fra slakte til frysing av alikvoter til -80 ° C skal utføres i løpet av en arbeidsdag og oppbevaring av renset protein ved temperatur enn -80 ° C bør unngås. Også har gjentatte fryse-tine sykluser vist seg å ha negativ effekt på stabiliteten av visse epitoper en.
_content "> Kapasiteten bør forventes å være i området fra 0,2 til 30 mg / l kultur. Mange har uttrykke i det øvre området, mens NAs tendens til å uttrykke på lavere nivåer. Også uttrykket nivåer FOR har synes å korrelere omvendt proporsjonalt med antallet av glykosyleringssteder. har fra menneskelig sesong H3N2 og sesong prepandemic H1N1 isolerer vanligvis viser lave nivåer, mens de fleste har av fugleinfluensa opprinnelse har høye uttrykk nivåer. For å bedre uttrykk, anbefales det å øke celletettheten i kolbe eller å prøve å bruke mindre eller mer arbeids lager per uttrykk. 10 ganger økning eller reduksjon av arbeids lager kan påvirke positivt på uttrykk nivåer. annen faktor som kan påvirke uttrykk nivåer er tiden mellom smitte og innhøsting. 96 hr er ideell for de fleste har, og NAs men kortere tider kan faktisk øke utbyttet av noen proteiner.Insektceller er i stand til å utføre posttranslational modifikasjoner i en nesten mammalian-aktig måte, og er i stand til å kaste veldig komplekse proteinstrukturer med lik effekt som pattedyrceller (men produsere høyere avkastning). I form av glykosylering, viser de et mønster som er litt forskjellig fra pattedyrceller og har stort sett paucimannosidic N-glykaner som mangler sialinsyre modifikasjoner 19. Imidlertid, insektcellelinjer som er blitt modifisert for å produsere pattedyr som glykosylering (inkludert terminal sialinsyre) er kommersielt tilgjengelige 14.
Baculovirus uttrykk systemet er et svært nyttig verktøy for uttrykk av de rekombinante influensaoverflate glykoproteiner - HA og NA. Disse rekombinante proteiner blir brukt i mange immunologiske og biokjemiske analyser, så vel som for standardisering av antigen innholdet i vaksiner og som antigen for vaksinasjonsforsøk i dyremodeller. Baculovirus-uttrykt HA-og NA oppviser fullt biologisk funksjon og korrekt folding hvis uttrykt i ramme med trimerizatipå og tetramerization domener hhv. Dette skiller dem fra bakteriell uttrykt har som er ikke-glykosylert og mangler funksjonelle epitoper i stilken domenet. Videre baculovirus expression innretningen oppviser betydelig høyere protein-utbytter enn pattedyrcellesystemer 26 og håndtering og oppskalering er lettere. I sammendrag vil vi beskrive en enkel og effektiv protokoll for å uttrykke store mengder av rekombinant influensavirus-HA-og NA-molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Patrick C. Wilson for monoklonalt antistoff CR9114. Vi takker også Jennifer Debeauchamp og Richard Webby for de opprinnelige A/Anhui/1/13 plasmider. Delvis støtte for dette arbeidet ble gitt av National Institute for Allergy og smittsomme sykdommer-finansiert program Prosjekt Grant AI097092-01A1 og CEIRS (Centers of Excellence for Influensa Forskning og overvåkning, HHSN26620070010C). FK ble støttet av en Erwin Schrödinger fellesskap (J 3232) fra den østerrikske Science Fund (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
