Summary
Здесь мы опишем способ выразить правильно сложенные и функциональные поверхностные антигены вируса гриппа, полученные из романа китайского вируса H7N9 в клетках насекомых. Этот метод может быть адаптирован, чтобы выразить эктодомены любых вирусных или клеточных поверхностных белков.
Abstract
Система бакуловирусом выражение представляет собой мощный инструмент для экспрессии рекомбинантных белков. Здесь мы используем его для производства правильно сложенные и гликозилированного версии вируса гриппа А поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). В качестве примера, мы выбрали HA и NA белки, выраженные нового вируса H7N9, который недавно появился в Китае. Однако протокол может быть легко адаптирована для HA и NA белков, выраженных любой другой гриппа А и вируса B штаммов. Рекомбинантный HA (Rha) и NA (РНК) белки являются важными реагенты для иммунологических анализов, таких как ELISPOT и ИФА, и также находятся в широком использовании для стандартизации вакцины, открытия антител, выделения и характеристики. Кроме того, рекомбинантные молекулы NA могут быть использованы для скрининга низкомолекулярные ингибиторы и могут быть использованы для определения характеристик ферментативной функции НС, а также его чувствительности к противовирусных препаратов. Рекомбинантные белки HA также байнг испытания в экспериментальных вакцин на животных моделях, и вакцина на основе рекомбинантного ГК недавно получил лицензию FDA для использования в организме человека. Способ описан здесь производить эти молекулы прямо вперед и может облегчить исследование в лабораториях гриппа, так как позволяет для производства больших количеств белков быстро и по низкой цене. Хотя здесь мы сосредоточены на вирус гриппа поверхностных гликопротеинов, этот способ также может быть использован для производства других вирусных и клеточных поверхностных белков.
Introduction
В первой реакции на появление в последнее время романа H7N9 гриппа штамма вируса в Китае, мы приобрели плазмиды, несущие геномные последовательности для гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гены первых двух изолятов. Используя эти плазмиды, мы смогли быстро построить бакуловирусные векторов экспрессии для получения рекомбинантного HA и NA в клетках насекомых. Эта система выражение хорошо известна в нашей лаборатории и доказал решающее значение для многих наших текущих исследовательских проектов 1-8. Клетки насекомых способны правильно сложить и посттрансляционно изменить сложные белки. Эти модификации включают N-гликозилирования, что очень важно для многих вирусных гликопротеинов. Таким образом, неудивительно, что система бакуловирус достаточно создана для выражения вируса гриппа поверхностные антигены. На самом деле, многие из кристаллических структур ГК и НС были решены с использованием клеток насекомых, выразил белков 9-11. Еще одно преимуществоСистема заключается в его надежных высоким содержанием белка выходом до 30 мг культуре клеток HA / л (на основе нашего опыта работы с более чем 50 различных белков HA) - следствие вирус-инфицирования в выражении от сильного промотора полиэдрина.
Удаление трансмембранным и endodomain белков HA и NA позволяет для экспрессии секретируемых, растворимых версий белков и, таким образом, значительно облегчает процесс очистки. Кроме того, эти эктодомены которые помечены гексагистидиновую и, следовательно, может быть очищен с помощью аффинной хроматографии с использованием Ni 2 +-смолы. Трансмембранные домены ГК и NA белков способствуют гомотримера и формирование гомотетрамера соответственно. Для того чтобы сохранить эти oligomerizations, мы добавляем С-концевой домен тримеризации для HA-и N-терминал тетрамеризации домена НС строит (рис. 1). Мы убедительно показали, что такая область тримеризация стабилизирует функциональное, последстrved конформационные эпитопы на стебель-домена ГК 1. Правильный тетрамеризации НС также может способствовать правильной укладки и функцию NA 10. Последовательности и векторы baculo-передачи, несущие тримеризации или тетрамеризации домены могут быть запрошены у авторов или из других лабораторий в области, 9,10,12.
Другим важным вопросом для экспрессии секретируемых белков в клетках насекомых является выбор правильного клеточной линии. В то время как Spodoptera frugiperda получены Sf9 клетки поддерживают бакуловирусной репликацию очень хорошо, и, как правило, используется для вируса спасательных и распространения, они обладают ограниченными возможностями для выделять большое количество белка. Trichoplusia Ni получены БТИ-TN-5B1-4 клеток (широко известный как High Five) имеют более высокую способность секреции и клеточная линия выбора для экспрессии в данном протоколе 13,14. Кроме того, было бы полезно, чтобы уменьшить или даже устранить фетальной бычьей сыворотки (FBS) от выражения культур. Поэтому мы используем средства массовой информации с уменьшенным (3%) содержанием FBS для выращивания рабочие запасы вируса, и мы выполняем экспрессию белка в сыворотке крови свободных СМИ.
Рекомбинантные HA и NA белки используются для многих иммунологических методов. Пожалуй, наиболее распространенным является в ИФА для измерения преобразование сыворотки после вакцинации у людей или животных 4,6,7,15. ГК и НАН также используются в ELISPOT анализов как оба стимулирующих молекул и реагентов обнаружения для антител секреции клеток 16. Их использование в качестве молекулярных приманки позволяет конкретно сортировки для plasmablasts или других типов В-клеток, которые затем могут быть использованы для выделения (терапевтических) моноклональные антитела (моноклональные антитела). Рекомбинантные HA и NA молекулы в дальнейшем используются в характеристике этих МКА 8. Другие примеры включают исследования устойчивости рН или рецептора специфику выразил различными изолятов вируса, или количественно оценки конкретных ферментативных NAдеятельность или устойчивость к ингибиторам. Кроме того, рекомбинантный очищенный HA может быть использован, чтобы стандартизировать содержание НА вируса гриппа инактивированных вакцин.
Важно отметить, что Rha (и в определенной степени NA) вакцин-кандидатов в настоящее время испытываются на животных моделях и клинических испытаниях на людях с одним кандидатом вакцин, лицензию FDA в 2013 году 2,17-19. Преимущество этих новых вакцин является то, что, в связи с рекомбинантной природе этих белков, трудоемкий процесс генерирования высоких роста реассортантных вирусов можно было бы избежать. Возможно, еще более актуальным является то, что их доходность HA высока и воспроизводится от штамма к штамму. Кроме того, поскольку эти вакцины производятся в системе без яиц, они не содержат белковые примеси, которые создают проблемы для лиц, страдающих аллергией яйцо.
Здесь мы выбрали, чтобы выразить белков HA и NA от двух изолятов романа китайской H7N9 вируса гриппа, A / Аньui/1/13 и A/Shanghai/1/13 20,21. Эти примеры своевременных, но описанный протокол может быть использован для экспрессии любого гриппа А и B НА или NA белков и может быть адаптирована, чтобы выразить любые другие секретируемые вирусных или клеточных белков. Тример или тетрамерные белки трансмембранные могут быть клонированы в кассетах экспрессии, используемых для НА и NA, соответственно. Тем не менее, наиболее растворимые секретируемые клеточные белки, как интерфероны, например, не нужен дополнительный домен для стабилизации и может быть выражена исключительно с С-концевой гексагистидиновой меткой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация рекомбинантного бакуловируса
- Клонирование в бакуловирусных трансфер-плазмид
- Клон H7 HA и N9 Н.А. эктодомен (или любой другой ген HA или NA) в модифицированных pFastBac плазмид передачи (см. введение). Векторы для HA, содержащий С-концевой домен тримеризации и гексагистидиновую метку, а также для NA, содержащий N-концевой домен тетрамеризации и гексагистидиновую метку, были описаны 1,10,11,22 (рис. 1) и может быть запрошена от авторы.
Пояснение: HA эктодомены выраженные без доменом тримеризации будет неправильно сложены, что приводит к потере конформационных нейтрализующих эпитопов, особенно в области стебля. Аналогично, функция Н.А. ферментативная опирается на соответствующую тетрамеризации. - Генерация bacmids
Transform бакуловирусных Transfer-плазмиды, содержащие HA и NA генов в DH10Bac бактерий в соответствии с использованием бакуловирусной выражениеСистема в соответствии с инструкциями изготовителя. Выделения и очистки bacmids использованием набора Midiprep в соответствии с инструкциями изготовителя (рис. 2).
- Клон H7 HA и N9 Н.А. эктодомен (или любой другой ген HA или NA) в модифицированных pFastBac плазмид передачи (см. введение). Векторы для HA, содержащий С-концевой домен тримеризации и гексагистидиновую метку, а также для NA, содержащий N-концевой домен тетрамеризации и гексагистидиновую метку, были описаны 1,10,11,22 (рис. 1) и может быть запрошена от авторы.
- Спасение рекомбинантного бакуловирусом и проверки экспрессии белка
Пояснительная записка: Следующие шаги должны быть выполнены в асептических условиях в ламинарном боксе. Выполните эту процедуру независимо для ГК и НС (или любой другой интерес гена). Клетки насекомых обычно выращивают при 28 ° С без CO 2. Клетки Sf9 для этого протокола выращивают в полной TNM-FH клеток насекомых среде с 10% FBS, 1% Pen-Strep * и 0,1% Pluronic F68 раствора, если не указано иное, и пассируют 1:04 два раза в неделю. Высокие Пять клетки выращивают в SFX сыворотки свободных СМИ и пассировать 1:15 два раза в неделю.
* Добавление антибиотиков следует рассматривать дополнительно в течение протокола и регулируется в соответствии с практикой, используемой в каждой лаборатории.- Пластина клеток насекомых Sf9 в 6-луночные планшеты при плотности 2 × 10 5 клеток / см 2 и оставьте на 20 мин в инкубаторе 28 ° C (без CO 2).
- Смешайте 2 мкг (конц. 0,5-2 мкг / мкл) рекомбинантного Бакмидную с 100 мкл TNM-FH среды (бессывороточной, 1% Pen-Strep). Смешайте 6 мкл трансфекции агента 100 мкл TNM-FH среды (сыворотки бесплатно, Пен-Strep). Объедините два тома, аккуратно перемешать и оставьте на 20 мин при комнатной температуре (трансфекции смесь). Включите одну макет трансфекции как контроля (рис. 3).
- Удалить супернатант из посеянных клеток Sf9 (клетки теперь придерживаться пластины) и заменить 2 мл свободного TNM-FH сыворотки средой, содержащей Pen-Strep (1%). Добавить полный объем трансфекции смеси, полученной на стадии (1.2.2) и рок пластину 6-луночные тщательно в течение 5 сек. Инкубировать в инкубаторе 28 ° C без CO 2 в течение 6 часов (рис. 3).
- Заменить медиа шго свежие полные TNM-FH СМИ (содержащие 10% FBS, 1% Pen-Strep и 0,1% Pluronic F68). Инкубировать в инкубаторе 28 ° C без CO 2 в течение 6 дней. Проверьте клетки иногда под микроскопом. Зараженные клетки обычно появляются больше, круглее, расширили ядра, и начать отделяться (рис. 4).
- Урожай клеток и подтверждения экспрессии белка
- Урожай клеток через 6 дней после трансфекции путем центрифугирования при 2000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Супернатант содержит рекомбинантного бакуловируса - это будет использоваться для генерации рабочих запасы сразу, или можно хранить при температуре 4 ° С в течение многих лет.
- Для проверки экспрессии белка собирать шарики и ресуспендируют в 500 мкл PBS. Смешать 50 мкл суспензии с 50 мкл SDS-PAGE загрузочного буфера (содержащего восстановитель). Запуск SDS-PAGE и выполнить Вестерн-блоттинга с анти-антителом гексагистидиновой подтвердить экспрессию генов. Включите клетки от макеттрансфекции в качестве отрицательного контроля (рис. 3).
- Подготовка рабочих запасов
- Пластина 5 х 10 5 Sf9 клеток / см 2 в T175 см 2 колбы и оставьте на 20 мин позволяют им придают блюду. Замените полную TNM-FH СМИ с TNM-FH средах, содержащих 3% FBS (и 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Инфицировать клетки с 100 мкл спасательной супернатанта. Выдержите в инкубаторе 28 ° C без CO 2 в течение 6 дней и время от времени проверять, если клетки заразиться (как описано в пункте 1.2.5.).
- Отжим при 2000 х г при комнатной температуре в течение 5 мин и собирают супернатант. Это теперь ваша Р2 складе. Этот запас может храниться бесконечно при 4 ° С. Повторите процедуру инфекции с помощью 100 мкл складе P2 заразить клетки. Полученный препарат называется P3 или работающих запас, который можно хранить при температуре 4 ° С или использовать непосредственно для экспрессии белка. P3 акции, как правило, содержит 10 <SUP> 7 -10 9 бляшкообразующих единиц / мл.
2. Белок Экспрессия и очистка
Пояснительная записка клетки Sf9 поддерживать рост бакуловирусом очень хорошо. Тем не менее, их способность выделять большое количество рекомбинантного белка ограничена. Поэтому мы используем другую линию клеток насекомых, High Five клетки, для выражения секретируемых рекомбинантных белков. Эти клетки не поддерживают репликацию бакуловируса до очень высоких титров 13 но имеют высокую секреторную способность.
- Выросший High Five клетки
Grow High Five клеток в SFX насекомое клеточной среде культуры в T175 см 2 колбы. Прохождение через день 1:03. Для культуры экспрессии 200 мл вам нужно будет расти 5 сливные колб. - Сбор и заражение High Five клетки
- Снять High Five клетки от 5 T175 см 2 колбы, нажав колбы рукой. Соберите клеток suspeпередать в 50 мл центрифужные пробирки nsion и.
- Отжим при 1200 х г в течение 7 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант отстаивают и объединить гранул ресуспендированием их в 15 мл P3 складе.
- Дайте настояться в течение 15 мин в капюшоне потока (рис. 5).
- Трансфер 200 мл Hyclone SFX культуральной среды в чистый, стерильный 1000 мл шейкер колбу (без buffles, запечатанную алюминиевой фольги перед автоклавированием, не должны были быть использованы для бактериальных культур раньше).
- Перенести подвеска P3/cell в шейкер колбу. Печать с стерильной алюминиевой фольги и передачи колбы в шейкере. Взболтать при 70 оборотах в минуту при 28 ° С в течение 72-96 часов.
- Сбор рекомбинантного белка от High Five экспрессии клеток супернатантов
- 72-96 ч после заражения передачи супернатанты культуры в 500 мл центрифугирования ведра. Отжим при 5500 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. В то же время промойте шейкере колбы 3x с дважды дистиллированной воде(DDH 2 O).
- Передача 3 мл Ni-смола суспензии в 50 мл пробирку с 45 мл PBS (один необходимы в культуре 200 мл). Хорошо встряхните и вращаются на 3000 мкг при комнатной температуре в течение 10 мин. Слейте PBS и держать шарик. Смешайте супернатант клеток насекомых с Ni-смолы гранул и передавать в уже промытыми встряхиваемых колбах. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение 2-4 ч, при встряхивании (рис. 6).
- Крепление 10 мл полипропилен на зажим на опорной стойке. Снимите обе крышки и поместите стакан под столбцом собрать поток через (отходов). Возьмем шейкер колбу из шейкере и начинают передавать супернатант / суспензионной смеси на колонку, он сохранит Ni-смолы и только супернатант будет течь через. Пройдите весь объем над колонной (рис. 7).
- Промыть смолы 4x 15 мл промывочного буфера (50 мМ Na 2 HCO 3, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, рН 8). Пусть все сливные промывочный буфериз колонки и закройте его крышкой (нижняя сторона).
- Добавить 2 мл буфера для элюции (50 ммоль Na 2 HCO 3, 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, рН 8) и оставьте на 5 мин. Откройте колонки и собирать элюата. Повторите это еще 3 раза (в общей сложности 8 мл элюирующего буфера). Элюат, который содержит высокие концентрации белка обычно показывает пену при встряхивании (рис. 7). Держите элюата на льду, когда это возможно.
- Буфер обмена и концентрации
- Prespin 15 мл ультрафильтрации центрифугирования единиц (30 кДа отрезные для HA / NA но может варьироваться в зависимости от очищенной размера белка) с PBS (рН 7,4-7,6) при 3000 мкг при 4 ° С в течение 20 мин. Отбрасываем течь через и нагрузка элюата на колонку спина. Залейте 5 мл стерильной, лед холодной PBS и спина в течение 60 мин при 3000 мкг при 4 ° С.
- При выпуске через раз, залейте 15 мл ледяной PBS и спина в течение 60 мин при 3000 мкг при 4 ° С. Повторите эту процеДюре еще раз.
- Возьмем столбец отжима из центрифуги и собирать буфера обмена концентрат (как правило, 200 мкл). Это имеет высокую концентрацию рекомбинантного белка. Промойте колонку отжима с 400 мкл стерильной лед холодной PBS и добавить к концентрату. Хранить концентрата на льду в любое время.
3. Характеристика и контроль качества
- Измерение концентрации белка
Возьмите аликвоту концентрата и измерить его с помощью вашего белка метод количественного выбора. Набор концентрации белка 1 мг / мл добавлением PBS и заморозить небольших аликвот до -80 ° С. Замораживание циклов оттаивания вред белковую структуру и может привести к агрегации. - SDS-PAGE и окрашиванием Кумасси
Запуск 500 нг вашего белка на SDS-PAGE и выполнить окрашивание Кумасси. Для быстрого и удобного окрашивания Кумасси использовать реагент в сочетании с протоколом СВЧ. HA белки обычно появляются на 64кДа, тогда как белки NA должен работать на размером около 56 кДа (8А и В). Используя описанную протокол, который вы не должны видеть никаких продуктов распада. Если деградация происходит это обычно является признаком загрязнения дрожжей / грибковой во время выражения. В этом случае повторите процедуру и убедитесь, что держать все стерильно. - Вестерн-блот / ИФА
Для того чтобы проверить идентичность белка мы рекомендуем сделать, чтобы блоте или ELISA анализа с специфическим антителом. В идеале, ELISA анализы выполняются с антителом, которое связывается с конформационных эпитопов (например, анти-HA стебель антитела 1). Использование такого антитела правильную укладку белка может быть подтверждена (рис. 8в). - Измерение Н.А. деятельность
Правильной укладки вирусной NA также может быть определено измерением активности Na. Мы рекомендуем выполнить этот тест с использованием коммерчески доступной Н.А. * звезды анализ (просто следуйте рекомендациям пользователей).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Молекулы ГК из A/Shanghai/1/13 и A/Anhui/1/13 хорошо выражена при урожайности около 20 мг / л культуры. Молекулы NA обоих штаммов показал умеренные уровни экспрессии, начиная от 0,2 мг / л культуры для A/Shanghai/1/13 до 0,7 мг / л для A/Anhui/1/13. Все четыре препараты белковые было очень мало, чтобы не примесей (8А и В) с уже будучи более высокой чистоты, чем ВПЛ, которые можно объяснить уровнем экспрессии. A/Shanghai/1/13 HA дополнительно анализировали с помощью ELISA с широко нейтрализующих стебель-реактивного человека МКА CR9114 23. Это мАт связывается с чувствительной конформационного эпитопа в области стебель и используется здесь в качестве зонда для правильной укладки этой области. Антитела показывает хорошее связывание, которое дает уверенность, что ГК действительно сложенный правильно (рис. 8C). Второй ELISA с анти-мышь H7 поликлональной сывороткой проводили для подтверждения идентичности полученного белка, из H7 происхождения (Рисунок 8D).
Рисунок 1. Схема ГК и NA экспрессирующих конструкций. Выражение для построения ГК (A) содержит N-концевой сигнальный пептид, за которой следует эктодомена HA, сайт расщепления тромбином, домен тримеризации T4 и гексагистидиновой меткой. Выражение конструкция Н.А. (В) содержит сигнальный пептид N-терминал с последующим гексагистидиновой меткой, сосудорасширяющее стимулирования фосфопротеин (VASP) домена тетрамеризации и эктодомена НС. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Схема Бакмидную порождающимион (как описано в стадии 1.1.2). бакуловирус-передача вектор, содержащий HA или NA гены превращается в DH10Bac бактерий. Рекомбинации в геном бакуловируса, что эти бактерии несут производит белую колонию фенотип отбора пластин. Белый колония определена и пересевали штрихом. Одну колонию от пересевали штрихом пластины использовали для инокуляции midiprep культуры.
Рисунок 3. Схема бакуловирусной спасательных и поколения рабочей фондовом (как описано в шагах 1.2.1-6). Рекомбинантный Бакмидную и трансфекции реагента разводят в бессывороточной TNM-FH среды. Два раствора объедин ют, смесь инкубируют в течение 20 мин, а затем переносили на клетках Sf9. Шесть часов после трансфекции трансфекции СМИ заменяется полным СМИ TNM-FH. Через шесть дней после трансфекции супернатант собирают и клеточный осадок анальныйyzed для экспрессии рекомбинантных белков.
Рисунок 4. Здоровые и инфицированные клетки Sf9. Sf9 клетки в (А) здоровы и неинфицированных. Они прикреплены к культуральной чашке, смотрите частично полиморфный и относительно небольшим. Клетки в (В) заражены бакуловирусом, отделяется от культуры блюдо, большие и круглые и расширили ядра. Ядро также показывает, гранулированный вид.
Рисунок 5. Заражение High Five клеток с рекомбинантным бакуловирусом (рабочих акции, как описано в шаге 2.2). Пять сливающиеся T175 колбы с High Five клеток собирают низкоскоростным центрифугированием и в сочетании с 15 мл P3 бакуловирусной складе. Через 15 мин винкубации клеток / вирус смесь переносят в 1000 мл шейкер колб 200 мл SFX массовой информации.
Рисунок 6. Урожай клеток супернатант 72-96 ч после инфекции и инкубации с Ni-NTA смолы (как описано на стадии 2.3). Зараженные клеточные суспензии собирают центрифугированием с низкой скоростью. Культуральные супернатанты смешивают с PBS-уравновешенную Ni-смолы и инкубировали в течение 2-4 часов при встряхивании.
Рисунок 7. Процедура очистки (как описано в 2.3 и 2.4) и контроль качества (как описано в шагах 3.1.1-4). После инкубации все супернатант / полимерной смеси загружают на колонках из полипропилена. Смола удерживается столбцов, а затем промывали четыре раза стиральной BUFFER и рекомбинантный белок элюируют 8 мл элюирующего буфера, используемых в 2 мл шагов. Элюат затем буфер обмена и концентрировали с спиновой ультрафильтрационной колонки, на аликвоты и замораживали. Контроль качества анализы включают SDS-PAGE, вестерн-блот, ИФА и измерение НС активности рекомбинантного НС.
Рисунок 8. Представитель результаты. HA (А) и NA (В) белки A/Anhui/1/13 и A/Shanghai/1/13 были проанализированы с использованием SDS-PAGE и окрашивания Кумасси. Структурная целостность ГК A/Shanghai/1/13 оценивали с помощью широко нейтрализующих стебель-реактивного антитела CR9114 человека, который связывается с чувствительной конформационного эпитопа (С). Идентичность же HA было подтверждено поликлональной анти-мышиной сыворотки H7 (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя выражение вируса гриппа HA и NA белков в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии, как правило, прямо вперед, есть несколько важных моментов, которые необходимо учитывать. Важно, как отмечалось во введении, что эктодомены ГК и НС выражены в слиянии с тримеризации или тетрамеризации доменов соответственно. Эти домены обеспечить правильную сборку молекул обычно при содействии трансмембранного домена, который не присутствует, если только эктодомен выражается. Например, выражение эктодомена HA без доменом тримеризации приводит к олигомеризации и дестабилизации важных эпитопов нейтрализующих в домене ножки 1. Кроме того, стабильность белков уменьшается и деградации на клетки насекомых и бакуловируса протеаз происходит. Выбор тримеризации домена или тетрамеризации менее важно, некоторые из них в пределах от лейцин молнии областей 22чтобы фага Т4 foldons 11 были протестированы до сих пор и все показали удовлетворительные результаты. Важно иметь в виду, что Многоосновные сайты расщепления, как они происходят в высоко патогенные изолятов H5N1 24 или H7N7 25 (но не в H7N9) должны быть устранены до выражения, так как они расщепляются фурина как протеаз, которые присутствуют во все времена в бакуловирус система экспрессии 1,12.
Другой возможной причиной деградационных продуктов является загрязнение с дрожжами или плесенью. Это может произойти уже в течение поколения производственные запасы и может остаться незамеченным во время хранения запасов при 4 ° С. Многие дрожжи и плесень предпочитают температуру между 20-30 ° С для оптимального роста и фактически ингибирует при 37 ° С, что температура общей культуры для клеток млекопитающих. Так как большинство антибиотиков, которые используются в клеточной культуре не эффективны против эукариотических организмов как дрожжи и плесень, культуры клеток насекомых является Performe д при оптимальных условиях роста этих бактерий дополнительная забота должны были быть предприняты с точки зрения обработки асептических культур. В дополнение к зарастанию клетки насекомых и подкисления СМИ, пресс-формы и дрожжи выразить много растворимых протеаз и, следовательно, может полностью деградировать рекомбинантных белков.
Проблема, которая иногда происходит осаждение в элюирующего буфера. Это редко можно увидеть и более или менее штамм специфического (например A/Vietnam/1203/04 H5 HA имеет тенденцию осаждаться), но могут быть предотвращены путем быстрого и полного обмена буфера на PBS. Хранение белков в имидазола, содержащие элюирующего буфера не рекомендуется. Процедура очистки от урожая к замораживанию аликвоты к -80 ° С должна быть выполнена в течение одного рабочего дня и хранение очищенного белка при температуре, отличной -80 ° C следует избегать. Кроме того, повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания, как было доказано негативно сказаться на устойчивости некоторых эпитопов 1.
_content "> Урожайность следует ожидать быть в диапазоне 0.2-30 мг / л культуры. Многие имеет выражают в верхнем диапазоне в то время как NAs как правило, выражают на более низких уровнях. Кроме того, уровни экспрессии для имеет видимому, коррелирует обратно пропорционально числу сайтов гликозилирования. имеет от человеческого сезонного гриппа H3N2 и сезонного prepandemic H1N1 изолятов обычно показывают низкие уровни экспрессии, тогда как наиболее ГК вируса птичьего гриппа происхождения имеют высокие уровни экспрессии. Для улучшения выражение рекомендуется увеличить плотность клеток в колбе или попробовать использовать меньше или больше работает фондовый за выражение. 10 кратное увеличение или уменьшение рабочей складе может повлиять положительно на уровне экспрессии. Другим фактором, который может повлиять на уровни экспрессии это время между заражением и урожая. 96 час идеально подходят для самых ГК и NAs но и более короткие периоды инкубации может на самом деле повысить урожайность некоторых белков.Клетки насекомых могут выполнять посттрансляционные модификации в почти млекопитающихн-как манера и способны свернуть очень сложные белковые структуры с аналогичными эффективности как клетки млекопитающих (но производить более высокие урожаи). С точки зрения гликозилирования, они демонстрируют образец, который немного отличается от клеток млекопитающих и особенности основном paucimannosidic N-гликаны, которые не имеют модификаций сиаловой кислоты 19. Однако клеточные линии насекомых, которые были модифицированы для производства млекопитающих как гликозилирования (включая терминал сиаловой кислоты) являются коммерчески доступными 14.
Система бакуловирусом выражение является чрезвычайно полезным инструментом для экспрессии рекомбинантных гриппа поверхностных гликопротеинов - HA и NA. Эти рекомбинантные белки используются для многих иммунологических и биохимических анализов, а также для стандартизации содержания антигенов вакцин и в качестве антигена для иммунизации экспериментах на животных моделях. Бакуловирусом выразил HA и NA проявляют полную биологическую функцию и правильную укладку, если выражается в рамке с trimerizatiна и тетрамеризации доменов соответственно. Это отличает их от бактерий выразил ГК, которые негликозилированный и не имеют функциональных эпитопов в домене стебля. Кроме того, система экспрессии бакуловируса показывает значительно более высокие выходы белка, чем клеток млекопитающих систем 26 и погрузки-разгрузки и масштабированием легче. В заключение мы описываем простой и эффективный протокол для выражения большого количества рекомбинантного вируса гриппа HA и NA молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Patrick C. Wilson для моноклональных антител CR9114. Мы также благодарим Дженнифер Debeauchamp и Ричард Webby для оригинальных плазмид A/Anhui/1/13. Частичная поддержка для этой работы была предоставлена Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний, финансируемый Проект Программа грантов AI097092-01A1 и CEIRS (Центры передового опыта по борьбе с гриппом исследований и надзору, HHSN26620070010C). ФК была поддержана общение Эрвин Шредингер (J 3232) от Австрийским научным фондом (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
