تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em> C. ايليجانس</em> مرحلة التطور الجنيني
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية تقسيم الصورة الخلايا داخل الأنسجة في انواع معينة ايليجانس الأجنة. بينما العديد من البروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلايا في صورة الجنين في وقت مبكر، ويصف هذا البروتوكول كيفية صورة انقسام الخلايا داخل الأنسجة النامية خلال منتصف أواخر مرحلة التطور الجنيني.
Abstract
يصف هذا البروتوكول استخدام مضان المجهري لصورة تقسيم الخلايا داخل تطوير انواع معينة ايليجانس الأجنة. على وجه الخصوص، يركز هذا البروتوكول على كيفية تقسيم الصورة neuroblasts، والتي توجد تحت خلايا البشرة وربما يكون من المهم للالبشرة التشكل. تشكيل الأنسجة أمر بالغ الأهمية لتحقيق التنمية metazoan وتعتمد على الإشارات الخارجية من الأنسجة المجاورة. C. ايليجانس هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة التشكل الأنسجة في الجسم الحي بسبب شفافيته وتنظيم بسيط، مما يجعل من السهل الأنسجة لدراسة عبر المجهر. الضميمة بطني هو عملية حيث يتم تغطية السطح البطني للجنين من قبل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية. ويعتقد أن هذا الحدث إلى أن تيسره neuroblasts الكامنة، والتي توفر التوجيه العظة الكيميائية للتوسط هجرة الخلايا الظهارية الفوقية. ومع ذلك، فإن neuroblasts هي التكاثري للغاية وأيضا قد تعملباعتبارها الركيزة الميكانيكية للخلايا البشرة بطني. الدراسات التجريبية باستخدام هذا البروتوكول يمكن الكشف عن أهمية التواصل بين الخلايا أثناء تكوين الأنسجة، ويمكن استخدامها للكشف عن أدوار الجينات المسؤولة عن انقسام الخلايا في الأنسجة النامية.
Introduction
في حين أن هناك بروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلية الصورة في أوائل C. ايليجانس الجنين، ويصف هذا البروتوكول كيفية انقسام الخلية صورة داخل الأنسجة خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. كان واحدا من التحديات الرئيسية في التصوير الحية خلال تطوير حساسيتها للالضيائية. ومع ذلك، فقد سمحت زيادة إمكانية الوصول إلى الغزل المجاهر القرص أو متحد البؤر المجهر حقل اجتاحت تطبيقات التصوير أكثر انتشارا. كلا النظامين استخدام الليزر في الحالة الصلبة والضوء المتناثرة، مما يحد من مستويات الأشعة فوق البنفسجية التي يتعرض لها الكائنات الحية ل. ومع ذلك، وتقف widefield ما زال بالإمكان استخدام للتصوير في الجسم الحي، وخاصة إذا تم تجهيزه أنهم مع الكاميرات مع حساسية عالية (على سبيل المثال EMCCD)، والتحكم في الفتحة والتحكم في الإضاءة (مثل المصابيح أو مصابيح الزئبق قابل للتعديل). يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إما نظام متحد البؤر مقرها أو نظام widefield لانقسام الخلايا الصورة داخل النامية C. ايليجانس <م /> الأجنة. كمثال على ذلك، ونحن تصف كيفية صورة انقسام الخلية أرومة عصبية. Neuroblasts قد تسهل البشرة التشكل من خلال توفير الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية للخلايا البشرة المغطي، وتوفر مثالا ممتازا على أهمية التواصل بين الخلايا في تشكيل الأنسجة.
انواع معينة ايليجانس هو كائن النموذج المثالي للدراسات المجهر مقرها نظرا لشفافيته وتنظيم الأنسجة بسيطة 1. وعلاوة على ذلك، C. ايليجانس هو قابل للطرق وراثية ورني، ولأن العديد من جيناته ديك المتماثلات الإنسان، فإنه يمكن استخدامها لتحديد آليات الحفظ لتكوين الأنسجة 2-5. في C. ايليجانس، تشكيل البشرة يحدث خلال مرحلة التطور الجنيني منتصف، حين يكون الجنين لديه> 300 الخلايا. تتكون البشرة التشكل من عدة مراحل رئيسية، حيث يتم وضع الجنين في طبقة من خلايا البشرة التي تؤدي إلى انقباض وتمدد إلى تحويل EMBRيو من نموذج بيضوي الشكل في شكل ممدود من دودة 6. يصف الضميمة بطني واحد من هذه الأحداث التخلق، عندما تهاجر خلايا البشرة بطني نحو خط الوسط بطني لتغطية السطح البطني للجنين (الشكل 1). الأولى، اثنين من أزواج من الخلايا الأمامية تقع حافة الرائدة تهاجر نحو خط الوسط بطني، حيث تلتزم والصمامات مع الجيران المقابل لها 6. ويعقب ذلك من خلال هجرة الخلفي تقع خلايا جيب، والتي تشكل إسفين مثل الأشكال خلق جيب بطني 6-7. ليست مفهومة جيدا الآلية التي يغلق الجيب. واحد الاحتمالات هو أن هيكل الأكتين الميوسين مقلص supracellular تربط الخلايا معا في جيب سلسلة محفظة مثل الأزياء، على غرار التئام الجروح 8. ومن المثير للاهتمام، يتم بوساطة هجرة بعض الخلايا جيب من قبل مجموعات فرعية معينة من neuroblasts الكامنة 9 (السلائف الخلايا العصبية التي توجد تحت epidermiق؛ الشكل 1B).
وأظهرت دراسات سابقة أن neuroblasts تنظيم الهجرة الخلية البشرة بطني والعلبة بطني. يتم التعبير عن VAB-1 (Ephrin مستقبلات) وVAB-2 (Ephrin يجند) غاية في neuroblasts وتسهيل فرز الأمامي والخلفي neuroblasts عن بعضها البعض، و الطفرات في VAB-1-2 أو VAB قضية الضميمة بطني الظواهر 10-13. ومع ذلك، أظهرت التجارب الانقاذ المروج ما هو مطلوب أيضا VAB-1 في خلايا البشرة المغطي بطني ومستقبلات للالعظة التوجيه الأخرى التي يفرزها neuroblasts يتم التعبير عنها في خلايا البشرة بطني 9. على الرغم من الطفرات في أي من هذه المستقبلات يسبب الظواهر الضميمة بطني، فإنه ليس من الواضح ما إذا كانت العيوب تنشأ بسبب مشاكل في أرومة عصبية لتحديد المواقع أو بسبب فشل خلايا البشرة بطني للرد على توجيهات جديلة 14. تغيير تقسيم neuroblasts وايthout تؤثر على قدرتهم على إفراز العظة التوجيه يمكن أن تسلط الضوء على دور neuroblasts وقدرتها على توفير المدخلات الميكانيكية خلال البشرة التشكل. في الآونة الأخيرة، فقد وجد أن الجين انقسام الخلايا، العاني-1 (anillin) ويعبر عن درجة عالية في neuroblasts (الشكل 2A) واستنزافها يسبب تشوهات الانقسام أرومة عصبية. ومن المثير للاهتمام، وعرض هذه الأجنة الظواهر الضميمة بطني (Fotopoulos، Wernike وPiekny والملاحظات غير منشورة).
مطلوب Anillin لانقسام الخلايا، وخاصة بالنسبة الانقسام السيتوبلازمي، الذي يصف عملية حيث يقسم الخلية الأم إلى خليتين جسديا ابنة. هو الدافع وراء الانقسام السيتوبلازمي قبل تشكيل عصابة مقلص أكتوميوزين، الذي يحتاج الى رقابة مشددة في المكان والزمان لضمان أن يقترن بشكل صحيح مع الكروموتيد العزل. المنظم سيد الانقسام السيتوبلازمي metazoan هو RhoA (RHO-1 في C. ايليجانس)، وGTPase الصغيرة التي هيالتفاعلية الذي نظمه في شكل محدد GTP لها. مرفق البيئة العالمية Ect2/ECT-2 ينشط RhoA، وبعد ذلك يتفاعل RhoA-GTP مع المستجيبات المصب التي تشكل حلقة مقلص والتوسط في ingression 15. Anillin هو بروتين المجال متعددة التي تربط لRhoA عبر لمحطة سي والأكتين والميوسين لها عبر N-محطة. مطلوب Anillin لتحقيق الاستقرار في الموقف من الحلبة مقلص في خلايا الثدييات أو ذبابة الفاكهة S2 16. استنزاف Anillin يسبب حلقات مقلص للخضوع التذبذبات الجانبية، والانقسام السيتوبلازمي في نهاية المطاف فشل تشكيل خلايا متعدد النوى 17-19. ومن المثير للاهتمام، على الرغم من C. ايليجانس العاني-1 إحداثيات أكتوميوزين انقباض في الجنين في وقت مبكر، فإنه ليس من الضروري لالحرائك الخلوية. ومع ذلك، كما هو موضح أعلاه، مطلوب العاني-1 لأرومة عصبية الانقسام السيتوبلازمي خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني (Fotopoulos، Wernike وPiekny والملاحظات غير منشورة). ان الفشل الانقسام السيتوبلازمي تغيير عدد وموقف neuroblasts ويمكن أن تؤثر على الموضعأوجه من العظة التوجيه الكيميائية، أو أنها يمكن أن يغير من الخواص الميكانيكية للأنسجة. تسليط الضوء على دور كلا النموذجين nonautonomous من neuroblasts لالضميمة بطني، وأهمية التواصل الأنسجة الأنسجة أثناء التطور الجنيني.
يصف هذا البروتوكول التجريبي كيفية انقسام الخلية خلال الصورة C. ايليجانس منتصف مرحلة التطور الجنيني باستخدام المجهر مضان. وقد أجريت غالبية التجارب دراسة آليات انقسام الخلايا في الخلايا واحد داخل أطباق الثقافة (على سبيل المثال. هيلا أو خلايا S2) أو في الأجنة في وقت مبكر مع عدد محدود من الخلايا (على سبيل المثال جيم ايليجانس الجنين خلية واحدة، القيطم، أو شوكي الأجنة). ومع ذلك، فمن المهم دراسة أيضا انقسام الخلايا داخل الأنسجة، كما أن هناك منبهات الخارجية التي يمكن أن تؤثر على توقيت ووضع الطائرة الانقسام. علاوة على ذلك، يمكن أن توفر الخلايا الاشارات الكيميائية أو الميكانيكية للتأثير على نمو أنسجة المجاورةق، وأنه من المهم أن نفهم كيف تساعد على التواصل بين الخلايا الأنسجة لتشكيل خلال التنمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول استخدام أنواع مختلفة من المجهري إلى انقسامات الخلية صورة خلال منتصف مرحلة التطور الجنيني. على وجه الخصوص، وهذا يسلط الضوء على البروتوكول كيفية تقسيم الصورة neuroblasts، الخلايا التي قد تسهل البشرة التشكل. الاتصالات خلية خلية المهم لتشكيل الأنسجة أثنا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن نعترف بأن هذا العمل كان مدعوما من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) منحة.
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- . C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. . Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
- Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
- Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
- Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
- Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
- Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
- Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
- Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
- Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
- Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
- Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
- Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
- Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
- Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
- Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Duerr, J. S. . Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
- Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
- Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
- Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
- Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
- Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
- Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
- Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
- Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).
