中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em> C.虫</em>胚
Summary
このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。
Abstract
このプロトコルは、 線虫（Caenorhabditis elegans）の胚の開発内のセルを分割するイメージに蛍光顕微鏡の使用が記載されている。特に、このプロトコルは、表皮細胞の下に見られ、表皮の形態形成に重要であり得る神経芽細胞を、割るどの画像に焦点を当てています。組織形成は、後生動物の開発のために重要であると、隣接する組織から外部の手がかりに依存しています。 で虫顕微鏡を通して勉強するために、その組織が 容易、、その透明性とシンプルな組織に生体内で組織の形態形成を研究するための優れたモデル生物である。腹側筐体は、胚の腹側表面は、上皮細胞の単層によって覆われているプロセスである。このイベントは、上に横たわる上皮細胞の遊走を媒介する化学的な指導の手がかりを提供する基礎となる神経芽細胞によって促進されると考えられている。しかし、神経芽細胞は、高度に増殖性であり、また働くことができる腹側表皮細胞のための機械的な基質として。この実験プロトコルを用いた研究は、組織形成の間に細胞間コミュニケーションの重要性を明らかにでき、現像組織内の細胞分裂に関与する遺伝子の役割を明らかにするために使用することができる。
Introduction
初期のC言語で画像細胞分裂する方法を記述したプロトコルがありますが虫胚 、このプロトコルは、どのように中期胚発生の間に組織内の画像細胞分裂に説明します。開発中に生物を画像化における主要な課題の一つは、光毒性に対する感受性となっている。しかし、回転ディスク共焦点顕微鏡または掃引視野顕微鏡へのアクセシビリティの向上は、より広範な画像処理アプリケーションを可能にした。両方のシステムは、生物体が曝露されるUVのレベルを制限する、固体レーザ散乱光を使用する。しかし、広視野スタンドはまだ彼らは、高感度（ 例えば EMCCD）、絞り制御や調光（ 例えば LEDまたは調整可能な水銀灯）を搭載したカメラも完備されています場合は特に、 生体内での画像化に使用することができます。このプロトコルは、C.を開発内の画像、細胞分裂に共焦点ベースのシステムや広視野システムのいずれかを使用する方法について説明します虫</ em>の胚。一例として、我々はどのように画像神経芽細胞分裂に説明します。神経芽細胞は、上にある表皮細胞に化学的または機械的な手がかりを提供することにより、表皮の形態形成を促進し、及び組織の形成において細胞間コミュニケーションの重要性の優れた例を提供してもよい。
線虫（Caenorhabditis elegans）は、その透明性とシンプルな組織体制1による顕微鏡観察に基づく研究のための理想的なモデル生物である。さらに、C.エレガンスは、遺伝的方法およびRNAiに適しており、その遺伝子の多くは、ヒト相同体を有するので、組織形成のために保存された2-5のメカニズムを同定するために用いることができる。 Cでエレガンスは 、表皮の形成は胚が> 300個の細胞を有する場合、中間胚形成の間に起こる。表皮の形態形成は、胚が収縮、表皮細胞の層で囲み、EMBRを変換するために拡張されている間、いくつかの主要な段階で構成されていワーム6の細長い形状に卵形のフォームからよ。腹側表皮細胞が胚（ 図1）の腹側表面を覆うように腹側正中線に向かって移動する際、腹側の筐体には、これらの形態形成のイベントのいずれかを説明します。まず、前方に位置する前縁細胞の2組は、その反対側の隣人6と腹彼らが付着正中線、ヒューズに向かって移動。これは、腹のポケット6-7を作成する図形のようなくさびを形成し、後方に位置するポケット細胞の遊走が続いている。ポケットを閉じメカニズムはよく分かっていない。一つの可能性は、細胞レベル以上のアクチンミオシン収縮構造は8創傷治癒と同様に、ファッションのような巾着で一緒にポケット細胞を結びつけることです。興味深いことに、ポケットセルの一部の移行はepidermiの下に発見され、基礎となる神経芽細胞の特定のサブセット9（神経前駆細胞によって媒介される秒; 図1B）。
以前の研究は、神経芽細胞が腹側表皮細胞遊走および腹側筐体を調節することを示したVAB-1（エフリン受容体）およびVAB-2（エフリンリガンド）は高度に神経芽細胞で発現させ、互いから前方および後方の神経芽細胞の選別を容易にし、及びVAB-1の突然変異またはVAB-2腹エンクロージャーの表現型の原因10月13日 。しかしながら、プロモーターレスキュー実験はVAB-1はまた、神経芽細胞によって分泌される他の指導の手がかりのため覆う腹側表皮細胞及び受容体は、腹側表皮細胞において発現される9で必要とされることを示した。これらの受容体のいずれかにおける突然変異は腹側筐体表現型を引き起こすが、欠陥がガイダンスに応答する神経芽細胞による位置決めにおける問題に起因又は腹側表皮細胞の障害を発生した場合、それは明らかではない14頭出し。神経芽細胞のWIの区分を変更すること指導の手がかりを分泌する能力に影響を与えるthout神経芽細胞の役割と表皮の形態形成の間に機械的な入力を提供する能力に光を当てることができます。最近では、細胞分裂遺伝子、 挙-1（anillin）は高度に神経芽細胞（ 図2A）で発現され、その枯渇は神経芽細胞分裂の欠陥を引き起こすことが見出された。興味深いことに、これらの胚は、腹側の筐体の表現型（Fotopoulos、WernikeとPiekny、未発表の観察）を表示します。
Anillinは、細胞分裂に必要であり、特に母細胞が物理的つの娘細胞に分割する方法を記載して細胞質分裂のためされる。細胞質分裂はきつく、それが適切に姉妹染色分体の分離と連結されることを保証するために空間及び時間的に制御する必要がアクトミオシン収縮環の形成により駆動される。後生動物細胞質分裂のマスターレギュレータはRhoAの（C.エレガンスにおけるRho-1）であり、低分子量GTPaseであるそのGTP結合型でのctive。 GEF Ect2/ECT-2はRhoAの-GTPが収縮環を形成し、その侵入15を仲介する下流のエフェクターと相互作用した後、RhoAのをアクティブにします。 Anillinは、そのC末端を介して、そのN末端を介して、アクチンとミオシンとのRhoAに特異的に結合するマルチドメインタンパク質である。 Anillinは、哺乳類やショウジョウバエS2細胞16における収縮環の位置を安定させるために必要とされている。 Anillin枯渇は、横振動を受けるように収縮環を引き起こし、最終的に細胞質分裂が多核細胞を17〜19を形成する失敗。興味深いことに、C.ものの虫ANI-1は、細胞質分裂に必須ではない、初期胚でアクトミオシンの収縮を調整します。しかし、上述したように、ANI-1は半ば胚発生（Fotopoulos、WernikeとPiekny、未発表の観察）の間、神経芽細胞質分裂に必要です。細胞質分裂の失敗は、神経芽細胞の数や位置を変更するであろうし、LOCに影響を与える可能性が化学的な指導の手がかりのATION、またはそれは、組織の機械的特性を変化させることができる。両モデルとも腹エンクロージャの神経芽細胞の非自律的役割、及び胚発生時の組織組織コミュニケーションの重要性を強調している。
この実験プロトコルは、C.の間にどのように画像細胞分裂に説明します蛍光顕微鏡を用いて、中間胚形成エレガンス 。細胞分裂のメカニズムを研究する実験の大部分は限られた数の細胞（ 例えば、C.一細胞胚、 アフリカツメガエル 、または棘皮動物エレガンスで培養皿（ 例 。HeLa細胞またはS2細胞）内の単一細胞または初期胚において行った胚）。しかし、分割面のタイミングおよび配置に影響を与えることができる外部の手がかりが存在するように、また組織内で細胞分裂を研究することが重要である。さらに、細胞が隣接する組織の発達に影響を与えるために化学的または機械的な手がかりを提供することができるS、それは細胞間の通信は、開発中に形成するために組織をどのように役立つかを理解することが重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、中期胚発生時の画像の細胞分裂への顕微鏡の様々な種類の使用が記載されている。特に、このプロトコルは、どのように表皮の形態形成を容易にすることができる神経芽細胞の分裂、細胞をイメージに強調しています。細胞間連絡は、後生動物の発生およびC.中の組織形成に重要である虫は、生体内で組織形成を研究するための優れたモデルです。うまく組?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この作品は自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）の助成金によって支えられていることを感謝したい。
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
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