Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em> C. elegans</em> Embryogenese
Summary
Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.
Abstract
Dit protocol beschrijft het gebruik van fluorescentie microscopie afbeelding delende cellen in ontwikkelingslanden Caenorhabditis elegans embryo. Vooral dit protocol gericht op het afbeelden verdelen neuroblasts, die zich bevinden onder de epidermale cellen en kan belangrijk zijn voor epidermale morfogenese zijn. Weefsel vorming is cruciaal voor metazoan ontwikkeling en vertrouwt op externe stimuli uit naburige weefsels. C. elegans is een uitstekend model organisme om weefsel morfogenese bestuderen in vivo vanwege de transparantie en eenvoudige organisatie, waardoor de weefsels gemakkelijk om te studeren via microscopie. Ventrale behuizing is het proces waarbij het ventrale oppervlak van het embryo is bedekt met een enkele laag van epitheelcellen. Deze gebeurtenis wordt gedacht te worden vergemakkelijkt door de onderliggende neuroblasts, die chemische begeleiding cues migratie van de bovenliggende epitheliale cellen mediëren. De neuroblasts zeer proliferatieve en ook kunnen fungerenals mechanische substraat voor de ventrale epidermale cellen. Studies met dit experimentele protocol kan het belang van intercellulaire communicatie ontdekken tijdens weefselvorming en kunnen worden gebruikt om de rol van genen betrokken bij celdeling in ontwikkelende weefsels te onthullen.
Introduction
Terwijl er protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege C. elegans embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een weefsel tijdens mid embryogenese. Een van de belangrijkste uitdagingen in de beeldvorming van organismen in ontwikkeling is hun gevoeligheid voor fototoxiciteit geweest. Echter, is toegenomen toegankelijkheid van draaiende schijf confocale microscopen of geveegd veld microscopen meer wijdverspreide beeldvorming toepassingen toegestaan. Beide systemen maken gebruik van solid state lasers en verstrooid licht, waardoor het niveau van UV die de organismen aan. Toch kan groothoek stands nog steeds worden gebruikt voor beeldvorming in vivo, vooral als ze zijn uitgerust met camera's met een hoge gevoeligheid (bijv. EMCCD), diafragma controle en lichtregeling (bijv. LED's of verstelbare kwik lampen). Dit protocol beschrijft hoe u ofwel een confocale gebaseerd systeem of een groothoek-systeem op de foto om de celdeling te gebruiken in ontwikkelingslanden C. elegans </ Em> embryo's. Als voorbeeld beschrijven we hoe u het neuroblast celdeling. Neuroblasts kan epidermale morfogenese vergemakkelijken door chemische of mechanische signalen naar de bovenliggende epidermale cellen en verschaffen een uitstekend voorbeeld van het belang van intercellulaire communicatie in de vorming van weefsels.
Caenorhabditis elegans is een ideaal modelorganisme voor microscopie op basis van studies door zijn transparantie en eenvoudige weefsel organisatie 1. Bovendien C. elegans vatbaar is voor genetische methoden en RNAi en omdat veel van de genen humane homologen, kan het gebruikt worden om geconserveerde moeten mechanismen voor weefselvorming 2-5. In C. elegans, vorming van de epidermis optreedt tijdens embryogenese midden, wanneer de embryo> 300 cellen. Epidermale morfogenese bestaat uit verschillende hoofdfasen, waarbij het embryo is ingesloten in een laag epidermale cellen die vernauwen verlenen tot de embr transformerenyo uit een eivormige vorm in de langwerpige vorm van een worm 6. Ventraal behuizing beschrijft een van deze morfogenetische gebeurtenissen, wanneer de ventrale epidermale cellen migreren naar de ventrale middellijn aan het ventrale oppervlak van de embryo (figuur 1) omvat. Ten eerste, twee paar voorste gelegen voorrand cellen migreren naar de ventrale middellijn, waar zij zich en zekering met de contralaterale 6 buren. Dit wordt gevolgd door de migratie van de achterste gelegen pocket cellen, die wig vormen achtige vormen creëren van een ventrale pocket 6-7. Het mechanisme dat de zak gesloten is niet goed begrepen. Een mogelijkheid is dat een supracellular actine myosine contractiele structuur bindt de zak cellen samen in een tas string als mode, vergelijkbaar met wondgenezing 8. Interessant is migratie van enkele pocket cellen gemedieerd door specifieke subsets onderliggende neuroblasts 9 (neuronale precursors die worden gevonden onder de epidermis: Figuur 1B).
Eerdere studies toonden aan dat de neuroblasts regelen ventrale epidermale celmigratie en ventrale behuizing. VAB-1 (Efrine receptor) en VAB-2 (Efrine ligand) zijn sterk uitgedrukt in de neuroblasts en sorteren van anterieure en posterieure neuroblasts vergemakkelijken van elkaar, en mutaties in VAB-1 of VAB-2 oorzaak ventrale behuizing fenotypen 10-13. Echter, promotor rescue experimenten toonden aan dat VAB-1 ook vereist in de bovenliggende ventrale epidermale cellen en receptoren voor andere begeleiding signalen afgescheiden door de neuroblasts zijn uitgedrukt in de ventrale epidermale cellen 9. Hoewel mutaties in een van deze receptoren leiden ventrale behuizing fenotypen, is het niet duidelijk of defecten ontstaan door problemen neuroblast positioneren of door uitval van de ventrale epidermale cellen te reageren op leiding keuen 14. Het veranderen van de verdeling van neuroblasts without waardoor hun vermogen om leiding signalen te scheiden zou licht werpen op de rol van neuroblasts en hun vermogen om mechanische input te geven tijdens epidermale morfogenese. Onlangs bleek dat een celdeling gen, ani-1 (anillin) sterk uitgedrukt in neuroblasts (figuur 2A) en de uitputting veroorzaakt neuroblast divisie defecten. Interessant is dat deze embryo's tonen ventrale behuizing fenotypes (Fotopoulos, Wernike en Piekny, ongepubliceerde waarnemingen).
Anillin nodig is voor celdeling, en met name voor cytokinese, waarbij het proces waarbij een moedercel fysiek verdeeld in twee dochtercellen beschreven. Cytokinesis wordt gedreven door de vorming van een actomyosine contractiele ring, die moet goed worden gecontroleerd in de ruimte en tijd om ervoor te zorgen dat deze goed is gekoppeld aan zusterchromatide segregatie. De meester regulator van metazoan cytokinesis is RhoA (RHO-1 in C. elegans), een klein GTPase dat is eenctive in zijn GTP-gebonden vorm. De GEF Ect2/ECT-2 activeert RhoA, waarna RhoA-GTP interageert met downstream effectoren dat de contractiele ring te vormen en te bemiddelen zijn binnentreden 15. Anillin is een multi-domein eiwit dat bindt aan RhoA via zijn C-terminus en actine en myosine via zijn N-terminus. Anillin nodig om de positie van de contractiele ring in zoogdier-of Drosophila S2 cellen 16 te stabiliseren. Anillin uitputting veroorzaakt contractie ringen om zijwaartse schommelingen die te ondergaan, en cytokinesis uiteindelijk faalt vormen meerkernige cellen 17-19. Interessant, hoewel C. elegans ani-1 coördinaten actomyosine contractiliteit in het vroege embryo, is het niet essentieel voor cytokinese. Zoals hierboven beschreven, ani-1 vereist voor neuroblast cytokinese in mid-embryogenese (Fotopoulos, Wernike en Piekny, ongepubliceerde waarnemingen). Cytokinesis mislukking zou het aantal en de positie van neuroblasts veranderen en kan invloed hebben op de locatie chemische begeleiding signalen, of het kan de mechanische eigenschappen van het weefsel te veranderen. Beide modellen benadrukken de nonautonomous rol van neuroblasts voor ventrale behuizing, en het belang van weefsel-weefsel communicatie tijdens de embryonale ontwikkeling.
Deze experimentele protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling tijdens C. elegans medio embryogenese met behulp van fluorescentie microscopie. De meeste experimenten bestuderen de mechanismen van celdeling werden in enkele cellen in kweekplaten (bijv.. HeLa of S2-cellen) of vroege embryo's met een beperkt aantal cellen (bijv. C. elegans eencellige embryo Xenopus of echinoderm embryo's). Het is echter belangrijk om tevens na celdeling in weefsels, er externe stimuli die de timing en plaatsing van het schot vliegtuig kan beïnvloeden. Verder kunnen cellen chemisch of mechanisch cues beïnvloeden de ontwikkeling van aangrenzende weefselss, en het is belangrijk te begrijpen hoe intercellulaire communicatie helpt weefsel te vormen tijdens de ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van verschillende soorten microscopie beeld celdelingen tijdens mid embryogenese. In het bijzonder, dit protocol benadrukt hoe het imago van de afdeling van neuroblasts, cellen die epidermale morfogenese kan vergemakkelijken. Cel-cel communicatie is belangrijk voor de vorming van weefsel tijdens metazoan ontwikkeling en C. elegans is een uitstekend model voor de vorming van weefsel te bestuderen in vivo. Een gebeurtenis die mooi beeldt het samenspel van weefsels epid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag erkennen dat dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) subsidie.
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- . C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. . Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
- Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
- Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
- Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
- Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
- Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
- Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
- Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
- Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
- Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
- Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
- Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
- Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
- Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
- Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Duerr, J. S. . Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
- Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
- Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
- Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
- Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
- Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
- Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
- Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
- Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).
