दौरान Neuroblast cytokinesis Visualizing<em> सी. एलिगेंस</em> Embryogenesis
Summary
इस प्रोटोकॉल छवि को Caenorhabditis एलिगेंस भ्रूण में एक ऊतक के भीतर कोशिकाओं को विभाजित कैसे करें. कई प्रोटोकॉल जल्दी भ्रूण में छवि कोशिका विभाजन के लिए, इस प्रोटोकॉल कैसे मध्य देर embryogenesis दौरान एक विकासशील ऊतक के भीतर कोशिका विभाजन छवि को बताता है कि कैसे का वर्णन करता है.
Abstract
इस प्रोटोकॉल Caenorhabditis एलिगेंस भ्रूण के विकास के भीतर कोशिकाओं को विभाजित छवि को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग का वर्णन करता है. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल एपिडर्मल कोशिकाओं के नीचे पाया जाता है और epidermal morphogenesis के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जो neuroblasts, विभाजित कैसे छवि पर केंद्रित है. ऊतक गठन metazoan विकास के लिए महत्वपूर्ण है और पड़ोसी ऊतकों से बाह्य संकेत पर निर्भर करता है. सी. एलिगेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अध्ययन करने के लिए इसके ऊतकों आसान बना रही है, इसकी वजह से पारदर्शिता और सरल संगठन के लिए vivo में ऊतक morphogenesis अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है. उदर बाड़े भ्रूण के उदर सतह उपकला कोशिकाओं की एक परत द्वारा कवर किया जाता है, जहां प्रक्रिया है. इस घटना overlying उपकला कोशिकाओं के प्रवास मध्यस्थता करने के लिए रासायनिक मार्गदर्शन cues प्रदान करने वाले अंतर्निहित neuroblasts, द्वारा सुविधा होने लगा है. हालांकि, neuroblasts अत्यधिक proliferative हैं और भी कार्य कर सकते हैंउदर एपिडर्मल कोशिकाओं के लिए एक यांत्रिक सब्सट्रेट के रूप में. इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का उपयोग अध्ययन ऊतक गठन के दौरान कहनेवाला संचार के महत्व को उजागर कर सकता है और विकासशील ऊतकों के भीतर कोशिका विभाजन में शामिल जीन की भूमिका का खुलासा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
कैसे छवि कोशिका विभाजन के लिए जल्दी सी. में वर्णन प्रोटोकॉल जबकि वहाँ एलिगेंस भ्रूण, इस प्रोटोकॉल कैसे छवि कोशिका विभाजन के मध्य embryogenesis दौरान एक ऊतक के भीतर का वर्णन करता है. विकास के दौरान जीवों इमेजिंग में प्रमुख चुनौतियों में से एक phototoxicity को उनकी संवेदनशीलता कर दिया गया है. हालांकि, कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी या बह क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी के लिए वृद्धि की पहुंच और अधिक व्यापक इमेजिंग अनुप्रयोगों की अनुमति दी है. दोनों प्रणालियों जीवों को उजागर कर रहे हैं कि यूवी के स्तर को सीमित करने, ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण और बिखरे हुए प्रकाश का उपयोग करें. हालांकि, widefield खड़ा अभी भी वे उच्च संवेदनशीलता (जैसे EMCCD), एपर्चर नियंत्रण और प्रकाश नियंत्रण (जैसे एल ई डी या समायोज्य पारा बल्ब) के साथ कैमरे के साथ outfitted कर रहे हैं, खासकर अगर vivo में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल सी. विकासशील भीतर छवि कोशिका विभाजन के लिए एक confocal आधारित प्रणाली या एक widefield प्रणाली या तो उपयोग कैसे करें एलिगेंस </ Em> भ्रूण. एक उदाहरण के रूप में, हम कैसे छवि Neuroblast कोशिका विभाजन को वर्णन. Neuroblasts overlying एपिडर्मल कोशिकाओं को रासायनिक या यांत्रिक cues प्रदान करके एपिडर्मल morphogenesis की सुविधा, और ऊतकों के गठन में कहनेवाला संचार के महत्व का एक उत्कृष्ट उदाहरण प्रदान कर सकता है.
Caenorhabditis एलिगेंस अपनी पारदर्शिता और सरल ऊतक संगठन 1 के कारण माइक्रोस्कोपी आधारित अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल जीव है. इसके अलावा, सी. एलिगेंस आनुवंशिक तरीकों और आरएनएआई करने के लिए उत्तरदायी है, और अपने जीन के कई मानव homologues है, यह ऊतक गठन 2-5 के लिए संरक्षित तंत्र की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सी. में भ्रूण> 300 कोशिकाओं है जब एलिगेंस, एपिडर्मिस के गठन, मध्य embryogenesis दौरान होता है. एपिडर्मल morphogenesis भ्रूण कसना कि एपिडर्मल कोशिकाओं की एक परत में संलग्न और embr परिणत करने का विस्तार कर रहा है, जिसके दौरान कई प्रमुख चरणों के होते हैं,एक कीड़ा 6 की लम्बी आकार में एक अंडाकार रूप से यो. उदर एपिडर्मल कोशिकाओं भ्रूण के उदर सतह (चित्रा 1) को कवर करने के लिए उदर midline की ओर विस्थापित जब उदर बाड़े, इन morphogenetic की घटनाओं का वर्णन करता है. सबसे पहले, पूर्वकाल स्थित अग्रणी धार कोशिकाओं के दो जोड़े उनके प्रतिपक्षी पड़ोसियों 6 के साथ उदर वे पालन जहां midline, और फ्यूज की ओर पलायन. यह एक उदर जेब 6-7 बनाने के आकार की तरह कील रूप है जो पीछे स्थित जेब कोशिकाओं के प्रवास के बाद है. जेब बंद कर देता है कि तंत्र में अच्छी तरह से नहीं समझा गया है. एक संभावना यह एक supracellular actin के मायोसिन सिकुड़ा संरचना 8 घाव भरने के लिए इसी तरह, फैशन की तरह एक पर्स स्ट्रिंग में एक साथ जेब कोशिकाओं कि संबंधों है. दिलचस्प है, जेब कोशिकाओं में से कुछ के प्रवास epidermi के नीचे पाया जाता है कि अंतर्निहित neuroblasts 9 (neuronal व्यापारियों के विशिष्ट सबसेट द्वारा मध्यस्थता हैएस, चित्रा 1 बी).
पिछले अध्ययनों neuroblasts. VAB -1 (ephrin रिसेप्टर) और VAB -2 (ephrin ligand) अत्यधिक neuroblasts में व्यक्त की और एक दूसरे से पूर्वकाल और कूल्हों neuroblasts की छंटाई की सुविधा रहे उदर एपिडर्मल सेल प्रवास और उदर बाड़े विनियमित पता चला है कि, और VAB -1 या VAB -2 कारण उदर बाड़े में म्यूटेशन 10-13 phenotypes. हालांकि, प्रमोटर बचाव प्रयोगों VAB -1 भी neuroblasts द्वारा स्रावित अन्य मार्गदर्शन cues के लिए overlying उदर एपिडर्मल कोशिकाओं और रिसेप्टर्स में आवश्यक है पता चला है कि उदर एपिडर्मल कोशिकाओं 9 में व्यक्त कर रहे हैं. इन रिसेप्टर्स में से किसी में म्यूटेशन उदर बाड़े phenotypes कारण हालांकि दोषों के कारण Neuroblast स्थिति में या कारण मार्गदर्शन करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए उदर एपिडर्मल कोशिकाओं की विफलता 14 cues के लिए समस्याओं का उत्पन्न होती है, यह स्पष्ट नहीं है. Neuroblasts वाई के विभाजन फेरबदलमार्गदर्शन संकेत छिपाना करने की क्षमता को प्रभावित करने thout neuroblasts की भूमिका और एपिडर्मल morphogenesis दौरान यांत्रिक इनपुट प्रदान करने की क्षमता पर प्रकाश डाला सकता है. हाल ही में, यह एक कोशिका विभाजन जीन, आईएएनएस -1 (anillin) अत्यधिक neuroblasts (2A चित्रा) में व्यक्त किया है और इसकी कमी Neuroblast विभाजन दोष का कारण बनता है कि पाया गया था. दिलचस्प बात यह है कि इन भ्रूणों उदर बाड़े phenotypes (Fotopoulos, Wernike और Piekny, अप्रकाशित टिप्पणियों) प्रदर्शित करते हैं.
Anillin कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक है, और विशेष रूप से एक मां सेल शारीरिक रूप से दो बेटी कोशिकाओं में बिताते हैं, जहां प्रक्रिया का वर्णन करता है जो cytokinesis, के लिए है. Cytokinesis कसकर यह ठीक से बहन chromatid अलगाव के साथ युग्मित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए स्थान और समय में नियंत्रित करने की आवश्यकता है जो एक actomyosin सिकुड़ा अंगूठी, के गठन के द्वारा संचालित है. metazoan cytokinesis के मास्टर नियामक RhoA (सी एलिगेंस में रो -1), एक है कि एक छोटे GTPase हैइसके जीटीपी समयबद्ध रूप में ctive. जीईएफ Ect2/ECT-2 RhoA-जीटीपी सिकुड़ा अंगूठी फार्म और इसके ingression 15 कि मध्यस्थता अनुप्रवाह effectors के साथ सूचना का आदान प्रदान, जिसके बाद RhoA सक्रिय. Anillin अपनी सी टर्मिनस के माध्यम से और अपने एन टर्मिनस के माध्यम से actin और मायोसिन को RhoA को बांधता है कि एक बहु डोमेन प्रोटीन है. Anillin स्तनधारी या ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं 16 में सिकुड़ा अंगूठी की स्थिति को स्थिर करने के लिए आवश्यक है. Anillin कमी पार्श्व दोलनों गुजरना करने के लिए सिकुड़ा छल्ले का कारण बनता है, और cytokinesis अंततः multinucleate कोशिकाओं 17-19 बनाने विफल रहता है. दिलचस्प है, हालांकि सी. एलिगेंस ani-1 यह cytokinesis के लिए आवश्यक नहीं है, जल्दी भ्रूण में actomyosin सिकुड़ना निर्देशांक. ऊपर वर्णित के रूप में हालांकि,, आईएएनएस -1 मध्य embryogenesis (Fotopoulos, Wernike और Piekny, अप्रकाशित टिप्पणियों) के दौरान Neuroblast cytokinesis के लिए आवश्यक है. Cytokinesis विफलता neuroblasts की संख्या और स्थिति बदल जाएगा और नियंत्रण रेखा को प्रभावित कर सकता हैरासायनिक मार्गदर्शन cues के व्यावहारिक, या यह ऊतक के यांत्रिक गुणों को बदल सकता है. दोनों मॉडल उदर बाड़े लिए neuroblasts के nonautonomous भूमिका, और भ्रूण के विकास के दौरान ऊतक ऊतक संचार के महत्व पर प्रकाश डाला.
इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे छवि कोशिका विभाजन के दौरान सी. एलिगेंस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग मध्य embryogenesis. कोशिका विभाजन के तंत्र के अध्ययन के प्रयोगों के बहुमत कोशिकाओं की एक सीमित संख्या में (जैसे सी. एक सेल भ्रूण, Xenopus, या शल्य चर्म एलिगेंस साथ संस्कृति व्यंजन (जैसे. हेला या S2 कोशिकाओं) के भीतर एकल कक्षों में या जल्दी भ्रूण में प्रदर्शन किया गया भ्रूण). हालांकि, यह विभाजन विमान के समय और स्थान को प्रभावित कर सकते हैं कि बाह्य संकेत कर रहे हैं, के रूप में भी ऊतकों के भीतर कोशिका विभाजन अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, कोशिकाओं पड़ोसी ऊतक के विकास को प्रभावित करने के लिए रासायनिक या यांत्रिक cues प्रदान कर सकता हैएस, और यह कहनेवाला संचार के विकास के दौरान फार्म करने के ऊतकों में मदद करता है समझने के लिए कैसे महत्वपूर्ण है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल मध्य embryogenesis दौरान छवि कोशिका विभाजन को माइक्रोस्कोपी के विभिन्न प्रकार के उपयोग का वर्णन करता है. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल कैसे एपिडर्मल morphogenesis सुविधा हो सकती है कि neuroblasts के विभाजन, कोशिकाओं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस काम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC अनुदान इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था कि स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
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