Выделение Double Negative αβ Т-клеток из почек
Summary
DNabT клетки редки среди периферийных Т-клеток; однако, они широко распространены в определенных нелимфоидных тканей. Сложность выделения DN Т-клеток от не-лимфоидной ткани препятствует их функционального анализа, несмотря на рост признал патофизиологического значение. Мы опишем протокол нового для изоляции высокоочищенных DN Т-клеток из мышиных почки.
Abstract
Там в настоящее время нет стандартный протокол для выделения DN Т-клеток от не-лимфоидных тканях, несмотря на их более сообщил участия в различных иммунных реакций. DN Т-клетки являются уникальной иммунной тип клеток, который был вовлечен в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций и толерантность к аллотрансплантаты 1-6. DN Т-клетки, однако, редко встречается в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах), но являются основными жители здоровую почку. Очень мало известно об их патофизиологической функции 7 из-за их малочисленности на периферии. Мы недавно описал комплексную фенотипическую и функциональный анализ этой группы населения в почках 8 в стационарном состоянии и во время ишемии реперфузионного повреждения. Анализ функции DN Т-клеток будет значительно повышена путем разработки протокола для их изоляции от почки.
Здесь мы описываем новый протокол, позволяющий isolatioн высокочистых AB CD4 + CD8 + Т-клеток и DN Т-клеток от мышей почки. Вкратце, мы переварить ткань почки с помощью коллагеназы и изолировать почек одноядерные клетки (KMNC) по градиенту плотности. Далее следуют два этапа по обогащению гемопоэтических Т-клетки с 3% до 70% от KMNC. Первый шаг состоит из позитивной селекции кроветворных клеток с использованием CD45 + набор для выделения. На втором этапе, DN Т-клетки негативно выдел ют путем удалени не-желательных клеток с использованием CD4, CD8 и МНС класса II моноклональные антитела и CD1d α-GalCer тетрамер. Эта стратегия приводит к населением более 90% чистых DN Т-клеток. Поверхность окрашивание указанных выше антител с последующим анализом FACS используется для подтверждения чистоты.
Introduction
Периферийное αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – дважды отрицательный (DN) Т-клетки делятся на различные подмножества, которые обладают различные фенотипы и функции 1-4. DN Т-клетки плохо изучены, но все чаще участвуют в патофизиологических иммунных реакций в различных моделях болезни 4-6.
DN Т-клетки представляют собой уникальный тип клеток иммунной что все чаще участвует в регуляции различных иммунных и аутоиммунных реакций и модуляции аллотрансплантата толерантности. 4-6, 9 Они редки в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах ). Тем не менее, они являются основными жителями нормальной почек и кишечника эпителия 10-12. Очень мало известно об их функции 7 в почках в стационарном состоянии и при патологических состояниях, таких как острого повреждения почек (AKI), связанные с почечной Transplмуравей.
Из-за сложных ролей различных иммунных клеток в регуляции иммунных реакций, включая alloresponses, определение роли каждого игрока имеет решающее значение в понимании alloresponses и разработке новых терапевтических средств. Учитывая значительное число DN Т-клеток, присутствующих в почках под физиологических и различных болезненных состояний, Д. Н. Т-клетки, вероятно, играют важную роль в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций у мышей и людей, и alloresponses в реципиентов. Накопление хотя все еще рассеянного доказательств подразумевает DN Т-клеток в обоих патогенных и иммуносупрессивных функций, но он плохо понимал, почему и как они проявляют определенную вредных или подавляющий функцию и, как окружающая среда влияет на них.
Из-за их низкой численности в почках, улучшенные методы выделения необходимы.
Там в настоящее время нет стандартный протокол для изоляции Ду Т-клеток из тон не-лимфоидных тканей. Наш протокол описывает новый способ для выделения DN Т-клеток из почки; Однако способ также может быть использован для различных нелимфоидных тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует растущий интерес к DN Т-клеток, так как они в настоящее время участвуют в различных патологических состояний, таких как аутоиммунные расстройства, рак, терпимости трансплантата и первичных заболеваний почек, включая острого повреждения почек (AKI), гломерулонефрит 8, 13. Т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIH PBS (R21 AI095484). Мы благодарим NHI тетрамерное основной объект для CD1d тетрамере.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
