Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim
Summary
DNabT células são raras entre as células T periféricas; no entanto, eles são abundantes em certos tecidos não linfóides. Dificuldade de isolar as células T DN a partir de tecidos não-linfóides dificulta a sua análise funcional, apesar do aumento reconhecida importância fisiopatológica. Descreve-se um novo protocolo para o isolamento de células altamente purificadas DN T de rim murino.
Abstract
Não existe actualmente nenhum protocolo padrão para o isolamento de células T DN dos tecidos não linfóides apesar do seu envolvimento cada vez relatada em diversas respostas imunitárias. DN células T são um tipo de células imunitárias única que tem sido implicado na regulação de respostas imunes e tolerância e auto-imunes a alotransplante 1-6. Células T DN são, no entanto, raro no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos), mas são os principais habitantes do rim normal. Muito pouco se sabe sobre sua função fisiopatológica 7, devido à sua escassez na periferia. Recentemente, descreveu uma análise fenotípica e funcional abrangente desta população no rim 8 em estado estável e durante a isquemia reperfusão. Análise da função das células T DN será consideravelmente reforçada através do desenvolvimento de um protocolo para o isolamento do rim.
Aqui, descrevemos um novo protocolo que permite isolation de células altamente puros ab CD4 + CD8 + T e células T DN do rim murino. Resumidamente, podemos digerir tecido renal utilizando colagenase e isolamento de células mononucleares de rim (KMNC) por gradiente de densidade. Isto é seguido por dois passos para enriquecer as células T hematopoiéticas de 3% a 70% de KMNC. A primeira etapa consiste de uma selecção positiva de células hematopoéticas CD45 + usando um kit de isolamento. No segundo passo, as células T são DN negativamente isolado por remoção das células não desejadas usando CD4, CD8, e anticorpos monoclonais de MHC de classe II e CD1d α-GalCer tetrâmero. Esta estratégia conduz a uma população de mais do que 90% de células T DN puros. Coloração de superfície com os anticorpos acima mencionados, seguida por análise FACS é usado para confirmar a pureza.
Introduction
Peripheral αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – double-negativo células (DN) T são divididos em vários subgrupos que possuem fenótipos e funções 1-4 distintas. DN células T são pouco compreendidos mas cada vez mais a ser implicadas nas respostas imunes fisiopatológicas em diferentes modelos de doença 4-6.
Células DN T são um tipo de célula imunológica única que é cada vez mais implicados na regulação de várias respostas imunes e auto-imunes ea modulação da tolerância alotransplante. 4-6, 9 Eles são raros no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos ). No entanto, eles são os principais moradores do rim e intestino epitélio normal 10-12. Muito pouco se sabe sobre sua função 7 no rim no estado estável e em condições patológicas como lesão renal aguda (LRA), associados com transpl renalformiga.
Devido às funções complexas de células imunes diferentes na regulação de respostas imunes, incluindo alloresponses, a definição do papel de cada jogador é fundamental na compreensão alloresponses e concepção de novas terapias. Dado o número significativo de células T DN presentes no rim em condições fisiológicas e de doenças diferentes, as células T DN são susceptíveis de desempenhar um papel crítico na regulação das respostas imunológicas e auto-imunes em ratos e seres humanos, e alloresponses em receptores de transplante. Acumulando embora a evidência ainda espalhados implica células T DN em ambas as funções patogênicos e imunossupressores, mas é mal compreendido por que e como eles exibem uma função prejudicial ou supressiva específico e como o ambiente influencia-los.
Devido à sua fraca abundância no rim, métodos melhorados de isolamento são necessárias.
Não há atualmente nenhum protocolo padrão para isolamento de células T DN de the tecidos não linfóides. Nosso protocolo descreve um novo método para o isolamento de células T DN do rim; No entanto, o método também pode ser utilizado para vários tecidos não linfóides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há cada vez mais interesse em células T DN, uma vez que estão sendo implicados em diferentes condições patológicas, como doenças auto-imunes, câncer, tolerância enxerto e doenças primárias do rim, incluindo lesão renal aguda (LRA), glomerulonefrite 8, 13. Portanto, há necessidade de melhor compreender e caracterizar as funções fisiopatológicos de células T DN. No entanto, atualmente há uma falta de compreensão da função dessas células, em comparação com CD4 e células T CD8. Uma das pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIH PBS (R21 AI095484). Agradecemos NHI tetramer instalação do núcleo para CD1d tetrâmero.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
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