Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene
Summary
Cellule DNabT sono rari tra cellule T periferiche; tuttavia, sono abbondanti in alcuni tessuti non linfoidi. Difficoltà di isolare le cellule T DN dal tessuto linfoide non ostacola la loro analisi funzionale, nonostante l'aumento riconosciuto significato fisiopatologico. Descriviamo un nuovo protocollo per l'isolamento di cellule altamente purificate DN T di rene murino.
Abstract
Attualmente non esiste un protocollo standard per l'isolamento delle cellule T DN dai tessuti non linfoidi nonostante il loro coinvolgimento sempre segnalato in varie risposte immunitarie. Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è stato implicato nella regolazione delle risposte immunitarie e la tolleranza e autoimmuni di allotrapianto 1-6. Cellule DN T sono, tuttavia, rare nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e linfonodi), ma sono i principali abitanti del rene normale. Molto poco si sa circa la loro funzione fisiopatologico 7 a causa della loro scarsità in periferia. Abbiamo recentemente descritto una vasta analisi fenotipica e funzionale di questa popolazione nel rene 8 in stato stazionario e durante ischemia riperfusione. Analisi della funzione delle cellule T DN sarà notevolmente migliorata con lo sviluppo di un protocollo per il loro isolamento dal rene.
Qui, descriviamo un nuovo protocollo che consente isolation di CD8 + cellule altamente puri ab CD4 + T e le cellule T DN dal rene murino. In breve, abbiamo digerire tessuto renale con collagenasi e isolare le cellule mononucleate del rene (KMNC) dal gradiente di densità. Questo è seguito da due passaggi per arricchire cellule T ematopoietiche dal 3% al 70% dal KMNC. La prima fase consiste in una selezione positiva di cellule ematopoietiche CD45 + utilizzando un kit di isolamento. Nella seconda fase, le cellule T sono DN negativamente isolati mediante rimozione delle cellule non desiderati utilizzando CD4, CD8, e MHC di classe II anticorpi monoclonali e CD1d α-GalCer tetramero. Questa strategia porta ad una popolazione di cellule pure oltre il 90% DN T. Colorazione della superficie con gli anticorpi suddetti seguita mediante analisi FACS è utilizzato per confermare la purezza.
Introduction
Periferico αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – doppio negativo cellule (DN) T sono suddivisi in vari sottogruppi che possiedono fenotipi e funzioni 1-4 distinte. Cellule DN T sono poco conosciuti, ma sempre più spesso coinvolti nelle risposte immunitarie fisiopatologiche in differenti modelli di malattia 4-6.
Cellule DN T sono un tipo di cellula immunitaria unico che è sempre più coinvolto nella regolazione delle varie risposte immunitarie e autoimmuni e la modulazione della tolleranza allotrapianto. 4-6, 9 sono rari nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari (milza e dei linfonodi ). Tuttavia, essi sono i principali abitanti della normale rene e intestino epitelio 10-12. Molto poco si sa circa la loro funzione 7 del rene in stato stazionario e in condizioni patologiche come danno renale acuto (AKI) associata a Transpl reneant.
A causa dei ruoli intricati di diverse cellule immunitarie nel regolare le risposte immunitarie, tra cui alloresponses, la definizione del ruolo di ogni giocatore è fondamentale per comprendere alloresponses e la progettazione di nuove terapie. Dato numero significativo di cellule DN T presenti nel rene in condizioni fisiologiche e diverse malattie, le cellule T DN sono suscettibili di svolgere un ruolo critico nel regolare le risposte immunitarie e autoimmuni nei topi e nell'uomo, e alloresponses nei pazienti trapiantati. Accumulare se prova ancora sparse implica cellule DN T in entrambe le funzioni patogeni e immunosoppressori, ma è poco conosciuta perché e come mostrano una funzione dannoso o soppressiva specifico e come l'ambiente li influenza.
A causa della loro bassa abbondanza nel rene, sono necessari metodi migliorati di isolamento.
Attualmente non esiste un protocollo standard per l'isolamento di cellule T DN da tegli tessuti non linfoidi. Il nostro protocollo descrive un nuovo metodo per l'isolamento di cellule T DN dal rene; Tuttavia, il metodo può essere utilizzata anche per vari tessuti non linfoidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi è un crescente interesse in cellule T DN poiché sono stati implicati in diverse condizioni patologiche, come disturbi autoimmuni, il cancro, la tolleranza del trapianto e malattie primarie di rene compresa insufficienza renale acuta (AKI), glomerulonefrite 8, 13. Pertanto, non vi è necessità di comprendere meglio e caratterizzare le funzioni fisiopatologiche delle cellule T DN. Tuttavia, attualmente non vi è una mancanza di comprensione della funzione di queste cellule rispetto ai CD4 e le cellule T C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal NIH PBS (R21 AI095484). Ringraziamo core facility tetramer NHI per CD1d tetramero.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
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