Summary

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

Published: May 16, 2014
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Summary

DNabT細胞は、末梢T細胞の中で稀であり;しかし、彼らは、特定の非リンパ組織に豊富に存在する。非リンパ組織からDN T細胞を単離することの難しさを認識病態生理学的有意性を増加させるにもかかわらず、それらの機能解析を妨げる。我々は、マウスの腎臓からの高度に精製されたDN T細胞の単離のための新規なプロトコルを記載している。

Abstract

非リンパ組織から、DN T細胞を単離するための標準的なプロトコルは、さまざまな免疫応答でのますます報告された関与にもかかわらず、現在ありません。 DN T細胞はallotransplants 1-6に免疫および自己免疫応答と寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。 DN T細胞は、しかしながら、末梢血および二次リンパ器官(脾臓およびリンパ節)において稀であるが、正常な腎臓の主要な居住者である。非常に少ない起因周辺での不足への病態生理学的機能7についてはほとんど知られていない。我々は最近、定常状態でおよび虚血再灌流障害時に腎臓8でこの集団の包括的表現型および機能解析を説明した。 DN T細胞機能の分析が大幅に腎臓からのそれらの単離のためのプロトコルを開発することによって強化される。

ここでは、isolatioを可能にする新たなプロトコルを記述マウス腎臓由来の高純度AB CD4 + CD8 + T細胞およびDN T細胞のnである。手短に言えば、我々は、コラゲナーゼを用いて腎組織を消化し、密度勾配によって腎臓単核細胞(KMNC)を単離する。これはKMNCから3%〜70%の造血T細胞を濃縮するために二つのステップが続く。最初のステップは、CD45 +単離キットを使用して、造血細胞の正の選択で構成されています。第二段階において、DN T細胞は負にCD4、CD8、およびMHCクラスIIモノクローナル抗体およびCD1dのα-GalCer類似四量体を用いた非所望の細胞の除去によって単離される。この戦略は、90%以上純粋なDN T細胞の集団をもたらす。 FACS分析に続いて、上述した抗体による表面染色は、純度を確認するために使用される。

Introduction

周辺αβTCR+ CD3 + CD4 CD8 ダ ​​ブルネガティブ(DN)T細胞は、明確な表現型を有し、1〜4機能の様々な部分集合に分割される。 DN T細胞は、あまり理解されていますが、ますます異なる疾患モデル4-6の病態生理学的な免疫応答に関与している。

DN T細胞は、ますます様々な免疫および自己免疫応答の調節および同種移植寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。4-6、9彼らは、末梢血および二次リンパ器官(脾臓及びリンパ節ではまれである)。しかし、彼らは正常な腎臓や腸上皮10月12日の主な居住者である。非常に少ないが、定常状態で、そのような腎臓transplに関連した急性腎障害(AKI)のような病理学的条件の下で、腎臓における機能7についてはほとんど知られていないANT。

なぜならalloresponsesを含む免疫応答を調節する上で様々な免疫細胞の複雑な役割のため、各プレイヤーの役割を定義するalloresponsesを理解し、新しい治療法を設計する上で非常に重要です。生理学的および異なる疾患状態の下で腎臓中に存在するDN T細胞の有意な数が指定され、DN T細胞は、移植レシピエントにおける免疫および自己免疫マウスおよびヒトにおける応答、およびalloresponsesの調節に重要な役割を果たしている可能性が高い。まだ散乱証拠かかわら蓄積すると、両方の病原性および免疫抑制機能のDN T細胞を関与しかし、なぜ、どのように特定の有害または抑制機能を発揮し、環境がそれらにどのように影響するかは十分に理解されていない。

により腎臓での少量に、分離する改良された方法が必要である。

Tから、DN T細胞を単離するための標準プロトコルが現在ありません彼は、非リンパ組織。我々のプロトコルは、腎臓からDN T細胞の単離のための新規な方法を記載している;しかしながら、この方法はまた、種々の非リンパ系組織のために使用することができる。

Protocol

1。楽器の調製、培養培地および試薬楽器:無菌条件下で試薬を準備し、層流フードの下で使用しています。 ウシ胎児血清5%、炭酸水素塩2.1gを10mlのグルタミン酸、100倍、HEPESを10mg、1mgのピルビン酸ナトリウム及び10mlの100倍のペニシリン/ストレプトマイシンを追加し、RPMI組織培地を1リットル調製する。 注:推奨される組織培養培地、RPMIは、DMEMと交換可能である。 <l…

Representative Results

野生型C57BL / 6(B6)腎臓は、腎臓あたり約1.5から2.1×10 6の単核細胞が含まれています。約10%未満は、造血CD45 +細胞である。 5%のコラゲナーゼを用いて消化し ​​、続いて、図1に示すように、腎臓単核細胞(KMNC)の調製のために、腎臓を小片に切断する。 これはKMNC層(図2、左パネル)を収集する密度勾配遠心分離を行うこと?…

Discussion

彼らはそのような自己免疫疾患、癌、移植性、および急性腎障害(AKI)を含む腎臓の原疾患、糸球体腎炎8、13の異なる病態に関与していることから、DN T細胞中の関心が高まっている。したがって、より良好なDN T細胞の病態生理学的機能を理解し、特徴付ける必要がある。しかしながら、現在CD4およびCD8 T細胞と比較して、これらの細胞の機能を理解する上で不足している。主な理由?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIHのPBS(R 21 AI095484)によってサポートされています。私たちは、CD1dの四量体のために薬価四量体中核施設に感謝します。

Materials

Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37°C with 5% CO2)
Microscope  Olympus Or equivalent equipment 
Analytical flow cytometer LSR II 
Name of the reagent Company  Catalog  Number Comments 
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare  17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich  S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10X Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich  E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience  G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend   103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience  12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience  8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated BD 553143
anti-MHC class II (I-A d) biotinylated BD 553609
anti-CD1d PBS-57 tetramer NHI tetramer  lote # 15621-PBS57
AutoMACS Running Buffer-  MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys – Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70mc filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
Petri Dish  Fisher Scientific S33580
Plate 24 wells  BD Biosciences 354723

References

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

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Cite This Article
Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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