Summary

Isolation de Double Negative αβ cellules T du rein

Published: May 16, 2014
doi:

Summary

Cellules DNabT sont rares chez les cellules T périphériques; cependant, ils sont abondants dans certains tissus non lymphoïdes. Difficulté d'isoler les cellules T DN à partir de tissus non lymphoïdes entrave leur analyse fonctionnelle malgré l'augmentation reconnu l'importance physiopathologique. Nous décrivons un nouveau protocole pour l'isolement de cellules T DN hautement purifiés à partir de rein de souris.

Abstract

Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules T DN à partir des tissus non lymphoïdes, malgré leur implication de plus en plus rapportée dans diverses réponses immunitaires. DN cellules T sont un type de cellule immunitaire unique qui a été impliquée dans la régulation des réponses immunitaires et de la tolérance aux allogreffes et auto-immunes 6.1. Cellules T DN sont cependant rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions rate et les ganglions), mais sont des résidents du rein normal. On sait très peu sur leur fonction physiopathologique 7 en raison de leur rareté dans la périphérie. Nous avons récemment décrit une analyse phénotypique et fonctionnelle complète de cette population dans le rein 8 dans l'état d'équilibre et pendant les lésions de reperfusion de l'ischémie. Analyse de la fonction des cellules T DN sera grandement améliorée par l'élaboration d'un protocole pour l'isolement du rein.

Ici, nous décrivons un nouveau protocole qui permet isolation de cellules hautement purs ab CD4 + CD8 + T et les cellules T DN du rein murin. En bref, nous digérer le tissu rénal en utilisant de la collagénase et d'isoler les cellules mononucléaires (rein) KMNC par gradient de densité. Ceci est suivi par deux étapes pour enrichir les cellules T hématopoïétiques de 3% à 70% de KMNC. La première étape consiste en une sélection positive des cellules hématopoïétiques CD45 + en utilisant un kit d'isolement. Dans la seconde étape, les cellules T sont isolées à DN négativement par élimination des cellules non désirées à l'aide de CD4, CD8, CMH de classe II et les anticorps monoclonaux et CD1d α-GalCer tétramère. Cette stratégie conduit à une population de plus de 90% de cellules T DN purs. la coloration de la surface avec les anticorps mentionnés ci-dessus, suivie par une analyse FACS est utilisée pour confirmer la pureté.

Introduction

Périphérique αβTCR + CD3 + CD4 CD8 double négatif cellules (DN) T sont divisés en différents sous-ensembles qui possèdent des phénotypes et des fonctions distinctes 1-4. Cellules T DN sont mal compris, mais de plus en plus impliqués dans les réponses immunitaires physiopathologiques dans différents modèles de maladies 4-6.

Cellules DN T sont un type de cellule immunitaire unique qui est de plus en plus impliqué dans la régulation de diverses réponses immunitaires et auto-immunes et la modulation de la tolérance allogreffe. 4-6, 9 Ils sont rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions de la rate et des ganglions lymphatiques ). Cependant, ils sont les principaux habitants du rein et de l'intestin épithélium normal 10-12. On sait très peu sur leur fonction 7 dans le rein à l'état stationnaire et dans des conditions pathologiques telles que l'insuffisance rénale aiguë (IRA) associée à rein transplfourmi.

En raison des rôles complexes de cellules immunitaires différentes dans la régulation des réponses immunitaires, y compris alloresponses, définissant le rôle de chaque joueur est critique dans la compréhension alloresponses et la conception de nouveaux produits thérapeutiques. Étant donné le nombre important de cellules T DN présents dans le rein dans des conditions physiologiques et pathologiques différentes, les cellules T DN sont susceptibles de jouer un rôle critique dans la régulation des réponses immunitaires et auto-immunes chez la souris et chez l'homme, et alloresponses chez les greffés. Accumuler si la preuve encore dispersés implique cellules T DN dans les deux fonctions pathogènes et immunosuppresseurs, mais il est mal compris pourquoi et comment ils présentent une fonction nuisible ou suppressive spécifique et comment l'environnement influe sur leurs décisions.

En raison de leur faible abondance dans le rein, l'amélioration des méthodes d'isolement sont nécessaires.

Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules de T DN Tes tissus non lymphoïdes. Notre protocole décrit un nouveau procédé pour l'isolement de cellules provenant du rein DN T; Cependant, le procédé peut également être utilisé pour divers tissus non lymphoïdes.

Protocol

1. Préparation des instruments, de la culture des médias et réactifs Instruments: Préparer les réactifs dans des conditions stériles et utiliser sous une hotte à flux laminaire. Préparer 1 litre de milieu de culture RPMI tissulaire, ajouter 5% de sérum fœtal bovin, 2,1 g de bicarbonate, de 10 ml de glutamate 100x, 10 mg d'HEPES, du pyruvate de sodium à 1 mg et de 10 ml de 100x de la pénicilline / streptomycine. Note: le milieu de culture tissulaire recommandé, RPMI, est inter…

Representative Results

Type sauvage C57BL / 6 (B6) rein contient environ 1.5 à 2.1 x 10 6 cellules mononucléées par les reins. Environ moins de 10% de CD45 + des cellules hématopoïétiques. Pour la préparation de cellules mononucléaires (rein KMNC), les reins sont découpés en petits morceaux comme le montre la figure 1, suivie par la digestion à l'aide de 5% de la collagénase. Ceci est suivi par l'exécution d'une centrifugation en gradient de densité …

Discussion

Il ya un intérêt croissant dans les cellules T DN car ils sont impliqués dans différentes pathologies telles que les troubles auto-immunes, le cancer, la tolérance du greffon, et les maladies primaires du rein, y compris insuffisance rénale aiguë (IRA), la glomérulonéphrite 8, 13. Par conséquent, il est nécessaire de mieux comprendre et caractériser les fonctions physiopathologiques de cellules T DN. Toutefois, actuellement, il ya un manque de compréhension de la fonction de ces cellules par rapp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par le NIH PBS (R21 AI095484). Nous remercions l'installation centrale de tétramère INSA de CD1d tétramère.

Materials

Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37°C with 5% CO2)
Microscope  Olympus Or equivalent equipment 
Analytical flow cytometer LSR II 
Name of the reagent Company  Catalog  Number Comments 
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare  17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich  S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10X Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich  E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience  G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend   103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience  12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience  8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated BD 553143
anti-MHC class II (I-A d) biotinylated BD 553609
anti-CD1d PBS-57 tetramer NHI tetramer  lote # 15621-PBS57
AutoMACS Running Buffer-  MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys – Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70mc filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
Petri Dish  Fisher Scientific S33580
Plate 24 wells  BD Biosciences 354723

References

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

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Cite This Article
Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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