गुर्दे से डबल नकारात्मक αβ टी कोशिकाओं के अलगाव
Summary
DNabT कोशिकाओं परिधीय टी कोशिकाओं के बीच में दुर्लभ हैं; हालांकि, वे कुछ गैर lymphoid ऊतकों में प्रचुर मात्रा में हैं. गैर lymphoid ऊतक से डी.एन. टी कोशिकाओं को अलग करने की कठिनाई pathophysiologic महत्व को मान्यता दी वृद्धि के बावजूद उनके कार्यात्मक विश्लेषण hinders. हम murine गुर्दे से उच्च शुद्ध डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
गैर lymphoid ऊतकों से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए कोई मानक प्रोटोकॉल विभिन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनके तेजी से सूचना मिली की भागीदारी के बावजूद वर्तमान में है. डी.एन. टी कोशिकाओं allotransplants 1-6 करने के लिए प्रतिरक्षा और autoimmune प्रतिक्रियाओं और सहिष्णुता को विनियमित करने में शामिल किया गया है कि एक अद्वितीय प्रतिरक्षा सेल प्रकार के होते हैं. डी.एन. टी कोशिकाओं परिधीय रक्त और माध्यमिक lymphoid अंगों (प्लीहा और लिम्फ नोड्स) में दुर्लभ है, तथापि, कर रहे हैं, लेकिन सामान्य गुर्दे के प्रमुख निवासी हैं. बहुत कम होने के कारण परिधि में उनकी कमी को उनके pathophysiologic समारोह 7 के बारे में जाना जाता है. हमने हाल ही में स्थिर अवस्था में और ischemia reperfusion चोट दौरान गुर्दे 8 में इस आबादी के लिए एक व्यापक प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण का वर्णन किया. डी.एन. टी सेल समारोह का विश्लेषण बहुत गुर्दे से उनके अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल के विकास के द्वारा बढ़ाया जाएगा.
यहाँ, हम isolatio अनुमति देता है एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णनmurine गुर्दे से अत्यधिक शुद्ध एबी सीडी 4 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं और डी.एन. टी कोशिकाओं के एन. संक्षेप में, हम collagenase का उपयोग गुर्दे ऊतक को पचाने और घनत्व ढाल से गुर्दे की कोशिकाओं mononuclear (KMNC) को अलग. इस KMNC से 70% से 3% से hematopoietic टी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए दो चरणों के बाद है. पहला कदम एक CD45 + अलगाव किट का उपयोग कर hematopoietic कोशिकाओं का एक सकारात्मक चयन के होते हैं. दूसरे चरण में, डी.एन. टी कोशिकाओं नकारात्मक सीडी 4, सीडी 8, और MHC वर्ग द्वितीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और CD1d α-galcer टेट्रामर का उपयोग गैर वांछित कोशिकाओं को हटाने से अलग कर रहे हैं. यह रणनीति अधिक से अधिक 90% शुद्ध डी.एन. टी कोशिकाओं की आबादी की ओर जाता है. FACS विश्लेषण द्वारा पीछा ऊपर उल्लेख किया एंटीबॉडी के साथ भूतल धुंधला शुद्धता की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Introduction
परिधीय αβTCR + CD3 + सीडी 4 – सीडी 8 – डबल नकारात्मक (डी.एन.) टी कोशिकाओं अलग phenotypes और कार्यों 1-4 कि अधिकारी विभिन्न सबसेट में विभाजित हैं. डी.एन. टी कोशिकाओं खराब समझ रहे हैं लेकिन तेजी से विभिन्न रोग मॉडल 4-6 में pathophysiological प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में फंसाया जा रहा है.
डी.एन. टी कोशिकाओं तेजी से विभिन्न प्रतिरक्षा और autoimmune प्रतिक्रियाओं के विनियमन और allotransplant सहिष्णुता के मॉडुलन में फंसा है कि एक अद्वितीय प्रतिरक्षा सेल प्रकार के होते हैं. 4-6, 9 वे प्लीहा और लिम्फ नोड्स (परिधीय रक्त और माध्यमिक lymphoid अंगों में दुर्लभ हैं ). हालांकि, वे सामान्य गुर्दे और आंत उपकला 10-12 के प्रमुख निवासी हैं. बहुत कम स्थिर अवस्था में गुर्दे में उनके कार्य 7 के बारे में और इस तरह के गुर्दे transpl के साथ जुड़े तीव्र गुर्दे चोट (अकी) के रूप में रोग की स्थिति के तहत जाना जाता हैचींटी.
क्योंकि प्रत्येक खिलाड़ी की भूमिका को परिभाषित करने, alloresponses सहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने में अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं का जटिल भूमिकाओं के alloresponses को समझने और नई चिकित्सा विज्ञान को डिजाइन करने में महत्वपूर्ण है. शारीरिक और विभिन्न रोग परिस्थितियों में किडनी में मौजूद डी.एन. टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या को देखते हुए, डी.एन. टी कोशिकाओं प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में एक महत्वपूर्ण चूहों और इंसानों में प्रतिरक्षा और autoimmune प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में भूमिका, और alloresponses खेलने की संभावना है. अभी भी बिखरे सबूत हालांकि जमते दोनों रोगजनक और immunosuppressive कार्यों में डी.एन. टी कोशिकाओं implicates लेकिन क्यों और कैसे वे एक विशिष्ट हानिकारक या दमनकारी समारोह प्रदर्शन और पर्यावरण उन्हें प्रभावित करती है कि कैसे यह बुरा समझा जाता है.
कारण गुर्दे में उनकी कम बहुतायत के लिए, अलगाव के तरीकों में सुधार जरूरी हैं.
टी से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए कोई मानक प्रोटोकॉल वर्तमान में हैवह गैर lymphoid ऊतकों. हमारे प्रोटोकॉल गुर्दे से डी.एन. टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है; हालांकि, विधि भी विभिन्न गैर lymphoid ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
वे इस तरह autoimmune विकार, कैंसर, भ्रष्टाचार सहिष्णुता, और तीव्र गुर्दे चोट (अकी) सहित गुर्दे की प्राथमिक रोगों के रूप में विभिन्न वैकृत शर्तों में फंसाया जा रहा है कर रहे हैं के बाद से डी.एन. टी कोशिकाओं में बढ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच पीबीएस (R21 AI095484) द्वारा समर्थित है. हम CD1d टेट्रामर के लिए NHI टेट्रामर कोर सुविधा धन्यवाद.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
