Syntese av en Intein-mediert Kunstig Protein Hydrogel

Summary

Vi presenterer syntesen av en splitt-intein-mediert protein hydrogel. Byggesteinene i denne hydrogel er to protein-kopolymerer som hver inneholder en subenhet av en trimere protein som fungerer som en kryssbinder og en halvdel av en splittet intein. Blanding av de to protein kopolymerer utløser en intein trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid enhet som selv setter sammen til en hydrogel. Denne hydrogel er sterkt pH-og temperatur-stabile, er forenelig med organiske løsningsmidler, og lett inkorporerer funksjonelle globulære proteiner.

Abstract

Vi presenterer syntesen av et meget stabilt protein hydrogel mediert av en splitt-intein-katalysert protein trans-skjøting reaksjon. Byggesteinene i denne hydrogel er to protein blokk-kopolymerer som hver inneholder en subenhet av en trimere protein som fungerer som en kryssbinder og en halvdel av en splittet intein. Et sterkt hydrofil tilfeldig spole er innsatt i en av blokk-kopolymerer for vannretensjon. Blanding av de to proteiner blokk-kopolymerer utløser en intein trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid med tverrbindingsenhet ved hver ende som raskt selv setter sammen til en hydrogel. Denne hydrogel er meget stabilt under både sure og basiske betingelser, ved temperaturer opp til 50 ° C og i organiske løsemidler. Den hydrogel raskt reformer etter skjær-indusert ruptur. Innlemmelse av en "docking station peptid" inn i hydrogelen byggeblokken muliggjør praktisk inkorporering av "docking protein"-merket målproteiner.Hydrogelen er kompatibel med vevskultur vekstmedier, støtter diffusjonen av 20 kDa-molekyler, og gjør det mulig for immobilisering av bioaktive globulære proteiner. Anvendelsen av intein-mediert protein hydrogel som et organisk-løsningsmiddel-forenlig biokatalysator ble demonstrert ved å innkapsle pepperrot peroksydase enzym og bekreftende dens aktivitet.

Introduction

Hydrogeler laget utelukkende av proteiner bære potensial til å avansere felt så forskjellige som tissue engineering, levering av legemidler og biofabrication ^en. De har fordeler i forhold til tradisjonelle syntetiske polymer hydrogeler inkludert biokompatibilitet og et potensial til invasivt støtte inkorporering av bioaktive globulære proteiner.

I dette arbeidet, vil vi beskrive utviklingen av et nytt protein hydrogel dannet via en splitt-intein-mediert protein trans-skjøting reaksjonen og dens anvendelse som et protein immobilisering stillaset (figur 1). Byggesteinene for denne hydrogel er to protein blokk-kopolymerer hver omfattende den N-eller C-terminale fragment av en splittet intein (IN og IC) og en subenhet av et multimert protein tverrbinder. Den DnaE intein fra Nostoc punctiforme (NPU) ble brukt som split intein ^2,3 og en liten trimere protein (12 kDa) CutA fra Pyrococcus horikoshii </ Em> ble anvendt som tverrbindingsprotein ^4,5. Forskjellige tverrbindere er sluttet gjennom intein katalysert trans-spleising reaksjon, som fører til dannelsen av et sterkt tverrbundet proteinnettverket (hydrogel). NPU intein ble valgt på grunn av sin raske reaksjonskinetikk (t _1/2 = 63 sek) og høy trans-spleising yield (nær 80%) ^2,3. Den CutA protein ble valgt som tverrbindingsmiddel på grunn av sin høye stabilitet. CutA trimerer har en denaturering temperatur på nær 150 ° C og beholde trimere kvaternær struktur i oppløsninger inneholdende så mye som 5 M guanidin-hydroklorid ^4,6. Siden subenheten utveksling mellom ulike crosslinkers er en stor bidragsyter til den fysiske hydrogel overflateerosjon ^7, bør den meget sterke inter subenheten samhandling i CutA fraråde slike subenheten børser, som fører til en mer stabil hydrogel. En av disse byggeklosser inneholder også et sterkt hydrofilt peptid S-fragment som midtblokken for å forenkle vannoppbevaring ^åtte.

Blanding av de to hydrogel byggeklosser initierer en trans-spleising reaksjonen mellom IN og IC intein fragmenter, generering av et lengre polypeptid-kjede med tverrbindingsmidler i begge terminaler. Tverrbindere fra flere slike molekylære enheter kommuniserer med hverandre og danner en meget kryssbundet hydrogel nettverk (figur 1A). En spesifikk "docking station peptid" (DSP) er innlemmet i en av de hydrogel byggeblokker for å lette stabil immobilisering av en "docking protein" (DP)-merket målprotein inn i hydrogelen. Bruk av et delt intein å mediere hydrogel sammenstillingen ikke bare gir ytterligere fleksibilitet for proteinsyntese hydrogel, men også gjør det mulig med høy tetthet, jevn belastning av målproteinet i hele hydrogel, som målproteiner lastes før hydrogel formasjonen.

Den intein-mediert protein hydrogel er svært stagjengelig i vandig oppløsning med liten til ingen påvisbar erosjon etter 3 måneder ved romtemperatur. Stabilitet er beholdt i et bredt spekter av pH-verdier (6-10) og temperaturer (4-50 ° C), og hydrogelen er også kompatibel med organiske løsningsmidler. Denne hydrogel blir brukt for immobilisering av to globulære proteiner: grønt fluorescerende protein (GFP) og pepperrotperoksidase (HRP). Hydrogel omslutte den sistnevnte protein blir brukt til å utføre biocatalysis i et organisk løsningsmiddel.

Protocol

En. Plasmid Construction MERK: Alle gener ble forsterket under standard PCR reaksjoner ved hjelp Phusion Høy Fidelity DNA Polymerase per produsentens spesifikasjoner. Primere benyttet for kloning er blitt beskrevet tidligere 9.. Alle konstruksjoner er oppført i Tabell 1. For å generere CutA-NpuN (N, Tabell 1): PCR forsterke CutA og NpuN gener fra plasmider pET30-CutA-Tip1 10 og KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11,…

Representative Results

En skjematisk for intein-mediert protein hydrogel dannelse er vist i figur 1A. Byggesteinene i hydrogel er proteinet kopolymerer CutA-NpuN (N) og NpuC-S-CutA (C) (Figur 1A, Tabell 1). NpuN / C er de N-/C-fragments av naturlig delt DnaE intein fra Nostoc punctiforme (NPU). CutA er stabile trimere protein fra Pyrococcus horikoshii 4,5. Blanding av renset N-og C i nærvær av reduksjonsmidlet DTT induserer dannelsen av et tredje protein – det ligert produkt (J: CutA-S-C…

Discussion

I dette arbeidet, viste vi syntesen av en svært stabil intein-mediert protein hydrogel. Bruk av et delt muliggjør intein hydrogel som skal betinget dannet i respons til en blanding av to væske-fase-komponenter. Nærmere bestemt, intein kovalent forbinder split to væske-fase byggeklosser via en trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid enhet flankert ved tverrbinding enheter som i sin tur selv setter sammen til en hydrogel. Blandingen-indusert dannelse av hydrogelen omgår tekniske vanskeligheter i…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR	90000-760
kanamycin sulfate	VWR	97061-602
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010
			[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM