Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel
Summary
Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta para um hidrogel. Este hidrogel é altamente pH e temperatura estáveis, compatíveis com solventes orgânicos, e facilmente incorpora proteínas globulares funcionais.
Abstract
Apresentamos a síntese de uma proteína de hidrogel altamente estável mediada por um catalisado-intein dividida proteína reacção de splicing trans. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. Uma bobina aleatório altamente hidrofílico é inserida em um dos copolímeros em bloco de retenção de água. A mistura dos dois copolímeros em bloco a proteína desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de polipeptídeo com agentes de reticulação em ambas as extremidades que rapidamente auto-monta em um hidrogel. Este hidrogel é muito estável tanto em condições ácidas e básicas, a temperaturas até 50 ° C, e em solventes orgânicos. O hidrogel rapidamente reformas após ruptura induzida por cisalhamento. Incorporação de um "encaixe estação peptídeo" para o bloco de construção de hidrogel permite incorporação conveniente de "proteína de ancoragem", marcado proteínas-alvo.O hidrogel é compatível com o meio de crescimento de cultura de tecidos, suporta a difusão de moléculas de 20 kDa, e permite a imobilização de proteínas globulares bioactivos. A aplicação do hidrogel proteína intein-mediada como um biocatalisador compatível com solvente orgânico foi demonstrada por encapsular a enzima peroxidase de rábano silvestre e corroborar a sua actividade.
Introduction
Os hidrogéis feitos inteiramente de proteínas carregam o potencial para avançar significativamente campos tão diversos como a engenharia de tecidos, distribuição de medicamentos e biofabrication 1. Eles oferecem vantagens sobre os hidrogéis de polímero sintético tradicionais, incluindo biocompatibilidade e o potencial para apoiar de forma não invasiva a incorporação de proteínas globulares bioactivos.
Neste trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um novo hidrogel de proteína formada por meio de uma resposta mediada intein dividida proteína reacção de splicing trans e sua aplicação como suporte de imobilização de proteína (Figura 1). Os blocos de construção para esta hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteína, compreendendo cada fragmento o N-ou C-terminal de uma divisão intein (IN e IC) e uma subunidade de uma proteína multimérica reticulador. O DNAE intein de Nostoc punctiforme (NPU) foi usada como o grupo intein 2,3 e uma pequena proteína trimérica (12 kDa) a partir de CUTA Pyrococcus horikoshii </ Em> foi usado como o agente de ligação cruzada de proteínas a 4,5. Diferentes agentes de reticulação são unidas por meio de reacção de splicing trans intein catalisada, levando à formação de uma rede de proteínas altamente reticulado (hidrogel). NPU intein foi escolhido por causa de sua cinética de reação rápida (t 1/2 = 63 seg) e alto rendimento trans-splicing (perto de 80%) 2,3. A proteína CUTA foi escolhido como o agente de ligação cruzada, devido à sua elevada estabilidade. Trímeros CUTA têm uma temperatura de desnaturação de perto de 150 ° C e manter a estrutura quaternária trimérico em soluções contendo tanto como 5 M de cloridrato de guanidina 4,6. Desde subunidade troca entre os diferentes agentes de reticulação é um dos principais contribuintes da superfície hidrogel físico erosão 7, a interação entre subunidade muito forte em Cuta deve desencorajar tais trocas de subunidades, levando a um hidrogel mais estável. Um desses blocos de construção também contém um peptídeo S-fragmento altamente hidrofílico como o meio-bloco para facilitar a águaretenção 8.
A mistura dos dois blocos de construção de hidrogel inicia uma reacção de splicing trans entre a IN e IC intein fragmentos, gerando uma corrente mais polipeptídeo com agentes de ligação cruzada em ambos os terminais. Reticuladores de várias de tais unidades moleculares interagir uns com os outros, formando uma rede de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Um específico "encaixe estação péptido" (DSP) é incorporado um dos blocos de construção de hidrogel a fim de facilitar a imobilização estável de uma "proteína de ancoragem" (DP) marcado com proteína alvo no hidrogel. O uso de uma divisão intein para mediar a montagem de hidrogel não só fornece flexibilidade adicional para a síntese de proteína de hidrogel, mas também permite alta densidade, carga uniforme da proteína alvo ao longo de todo o hidrogel, tal como as proteínas alvo são carregados antes da formação do hidrogel.
O hidrogel de proteínas mediada por intein é altamente stable em solução aquosa, com pouco ou nenhuma erosão detectável após 3 meses à temperatura ambiente. A estabilidade é mantida numa vasta gama de valores de pH (6-10) e de temperaturas (4-50 ° C), e o hidrogel é também compatível com solventes orgânicos. Este hidrogel é utilizado para a imobilização das duas proteínas globulares: a proteína fluorescente verde (GFP) e a peroxidase de rábano (HRP). Hidrogel aprisionando a última proteína é usada para executar biocatálise em um solvente orgânico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, nós demonstramos a síntese de uma proteína de hidrogel intein mediada altamente estável. O uso de uma divisão permite intein o hidrogel ser condicionalmente formada em resposta à mistura de dois componentes em fase líquida. Especificamente, a divisão intein covalentemente liga dois blocos em fase líquida através de uma reação de trans-splicing, produzindo uma unidade polipeptídeo ladeado por reticulação unidades que, por sua vez auto monta em um hidrogel. A formação induzida por…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o Dr. David Tirrell (Caltech), pelo seu dom tipo de plasmídeo pQE9 AC 10 ATRP 12, o Dr. Tom Muir (Universidade de Princeton), pelo seu dom tipo de plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japão), pelo seu dom tipo de plasmídeo pET30-cuta-Tip1 10, e Dr. Jay Keasling D. (UC Berkley) pelo seu dom tipo de plasmídeo pJD757 13 . Este trabalho foi apoiado em parte pela National Science Foundation CARREIRA, EUA Força Aérea YIP e Norman Hackman Programa Advanced Research.
Materials
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Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
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