一种由分裂型内含肽介导的人工蛋白质水凝胶的合成

摘要

我们介绍了由分裂内含肽介导的蛋白水凝胶的合成。该水凝胶的构建单元是两种蛋白共聚物，每种共聚物包含一个三聚体蛋白的亚基（作为交联剂）以及一半的分裂内含肽。混合这两种蛋白共聚物可触发内含肽反式剪接反应，生成可自组装形成水凝胶的多肽单元。该水凝胶具有高度的pH和温度稳定性，与有机溶剂相容，并可 facile 地整合功能性球状蛋白。

摘要

本文介绍了一种由分裂内含肽介导的蛋白质反式剪接反应催化的高稳定性蛋白质水凝胶的合成方法。该水凝胶的构建单元是两种蛋白质嵌段共聚物，每种共聚物均包含一个三聚体蛋白的亚基（作为交联剂）以及一半的分裂内含肽。其中一个嵌段共聚物中插入了一个高度亲水的无规卷曲结构以增强保水能力。两种蛋白质嵌段共聚物混合后触发内含肽反式剪接反应，生成两端带有交联剂的多肽单元，该单元可快速自组装形成水凝胶。该水凝胶在酸性和碱性条件下、温度高达50 °C时以及在有机溶剂中均表现出良好的稳定性。在剪切力导致断裂后，水凝胶可迅速重新形成。将“停靠站肽”引入水凝胶构建单元，可方便地实现“停靠蛋白”标记的目标蛋白的整合。该水凝胶与组织培养生长培养基相容，支持20 kDa分子的扩散，并可实现生物活性球状蛋白的固定化。通过包埋辣根过氧化物酶并验证其活性，展示了该内含肽介导的蛋白质水凝胶作为与有机溶剂相容的生物催化剂的应用潜力。

引言

完全由蛋白质构成的水凝胶有望显著推动组织工程、药物递送和生物制造等多个领域的发展¹。与传统的合成聚合物水凝胶相比，它们具有生物相容性优势，并有可能以非侵入方式支持生物活性球状蛋白质的掺入。

在本研究中，我们描述了一种通过分裂型内含肽介导的蛋白质反式剪接反应形成的新型蛋白质水凝胶的开发过程，并介绍了其作为蛋白质固定化支架的应用（图1）。该水凝胶的构建单元是两种蛋白质嵌段共聚物，每种共聚物包含一个分裂型内含肽的N端或C端片段（IN和IC），以及一个多聚体交联蛋白的一个亚基。分裂型内含肽采用源自Nostoc punctiforme（Npu）的DnaE内含肽^2,3，交联蛋白则采用来自Pyrococcus horikoshii的小型三聚体蛋白（12 kDa）CutA^4,5。不同的交联蛋白通过内含肽催化的反式剪接反应连接，从而形成高度交联的蛋白质网络（水凝胶）。选择Npu内含肽是因为其反应动力学快（t_1/2 = 63 秒）且反式剪接产率高（接近80%）^2,3。选择CutA蛋白作为交联剂则因其具有极高的稳定性：CutA三聚体的变性温度接近150 °C，并能在含有高达5 M盐酸胍的溶液中保持其三聚体四级结构^4,6。由于不同交联剂之间的亚基交换是导致物理水凝胶表面侵蚀的主要因素⁷

方案

1. 质粒构建

注意：所有基因均根据制造商说明，使用 Phusion 高保真 DNA 聚合酶在标准 PCR 反应条件下进行扩增。用于克隆的引物此前已有描述⁹。所有构建体均列于表 1中。

1. 为了生成 CutA-NpuN（N, 表1):
   1. 从质粒 pET30-CutA-Tip1 中 PCR 扩增 CutA 和 NpuN 基因¹⁰ 和 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN¹¹分别使用相应的引物。
   2. 用适当的限制性内切酶消化这些片段，并将这些片段依次插入 pET26b 载体中 T7 启动子与C端6xHis标签之间的位点，以构建 N (图 2A).
2. 生成 NpuC-S-CutA（C, 表1):
   1. PCR 扩增 NpuC、CutA 和 S 片段 [AG₃（聚乙二醇）[PEG]₁₀ 来自质粒 KanR-IntRBS-NpuNC-CFN¹¹pET30-CutA-Tip1¹⁰

结果

一种由内含肽介导的蛋白质水凝胶形成的示意图如下所示 图1A水凝胶的基本组成单元是蛋白质共聚物 CutA-NpuN (N) 和 NpuC-S-CutA (C)图1A, 表1）。NpuN/C 是来自点状念珠藻（Nostoc punctiforme，Npu）天然分裂的 DnaE 内含肽的 N-端和 C-端片段。CutA 是一种稳定的三聚体蛋白，来源于 Pyrococcus horikoshii^4,5在还原剂DTT存在下，将纯化的N端和C端混合可诱导形成第三种蛋白质——连接产物（J: CutA-S-CutA）。图1A 和 1C）。单独存在时，水凝胶构建单元N和C呈黏稠液体状（图1B将N与C混合后得到一种透明的半固体材料，倒置玻璃小瓶后该材料仍保留在瓶底，表明已形成水凝胶。^15,16 (图1B)^18,19.

讨论

在本研究中，我们展示了由分裂内含肽介导的高稳定性蛋白质水凝胶的合成。利用分裂内含肽可使水凝胶在两种液相组分混合后条件性地形成。具体而言，分裂内含肽通过转剪接反应共价连接两个液相构建单元，形成具有末端交联结构的多肽链，进而快速自组装成水凝胶。 转-剪接反应，生成两端带有交联单元的多肽片段，该片段进而自组装形成水凝胶。通过混合诱导水凝胶的形成，可避免单组分蛋白水凝胶合成过程中因凝胶化导致层析纯化柱堵塞的技术难题。此外，该水凝胶在生理条件下即可形成，无需任何外源性化学诱导剂和/或物理刺激。

由内含肽介导的水凝胶在酸性和碱性缓冲液中以及生理温度下均保持高度稳定。每种单个构建单元仅需0.8 mM即可形成水凝胶（数据未显示），但较高蛋白质浓度（约1.6 mM）可形成机械稳定性更佳的水凝胶。该水凝胶的高度稳定性归因于以下两点：1）采用非常稳定的三聚体蛋白CutA作为交联剂；2）利用内含肽共价连接不同的交联剂。对SDS-PAGE凝胶进行密度分析显示，约80%的输入蛋白成功完成了分裂内含肽催化的反式-剪接反应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England BioLabs	M0530S
有活性的 大肠杆菌 BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
劳里亚-伯特尼	VWR	90003-350
Bacto 琼脂培养基	VWR
硫酸卡那霉素	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
咪唑	VWR	EM-5720
尿素	VWR	EM-9510
二硫苏糖醇（DTT）	Fisher	BP172-5
蛋白酶抑制剂混合物	罗氏应用科学	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
亮蓝 R	Acros Organics	A0297990
叠氮化钠	Fisher	AC190380050	注意：剧毒
辣根过氧化物酶	Sigma	P8125-5KU
N,N-二甲基-p-苯二胺	Fisher	AC408460250	注意：剧毒
苯酚	Fisher	AC149340500	注意，剧毒
叔丁基过氧化氢	Fisher	AC180340050	注意：剧毒
正庚烷	Acros Organics	120340010
[标题]
摇床/培养箱	Fisher Scientific	Max Q 6000
离心	Sorvall	RC 6
超声波破碎仪	QSonica	Misonix 200
超滤管	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap 柱	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF 离子交换柱	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
酶标仪	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM