内含肽介导的人工蛋白水凝胶的合成
Summary
我们提出了一个分裂内含肽介导的蛋白水凝胶的合成。这种水凝胶的组成部分是各含有作为拆分内含肽的交联剂，和一个半三聚体蛋白质的一个亚单位2蛋白共聚物。两个蛋白共聚物的混合触发一个内含肽转拼反应，产生的多肽单元，其自组装成水凝胶。此水凝胶是高度的pH和温度稳定，与有机溶剂相容的，并且很容易地集成功能的球状蛋白。
Abstract
我们提出了一个高度稳定的蛋白水凝胶由一个分裂蛋白-蛋白催化的转拼反应介导的合成。这种水凝胶的组成部分有两个蛋白嵌段共聚物各自包含有作为拆分内含肽的交联剂，和一个半三聚体蛋白质的一个亚单位。一种高度亲水性的无规卷曲插入嵌段共聚物用于水保持量为1。两个蛋白的嵌段共聚物的混合触发一个内含肽转拼反应，产生具有交联剂的多肽单元在任一端，可以快速自组装成水凝胶。此水凝胶是非常稳定的酸性和碱性条件下，在温度高达50℃，并在有机溶剂中。剪切诱导破裂后的水凝胶迅速改革。成立一个“基座肽”到水凝胶积木使“对接蛋白”标记的靶蛋白的方便结合。所述水凝胶是用组织培养的生长培养基兼容，支持的20kDa的分子的扩散，并且使生物活性的球状蛋白质的固定化。内含肽介导的蛋白水凝胶作为有机溶剂相容的生物催化剂的应用证明了包封的辣根过氧化物酶和确证其活性。
Introduction
蛋白质完全由水凝胶携带可能显著推进领域等不同的组织工程，药物输送和biofabrication 1。它们比传统的合成聚合物水凝胶的优点，包括生物相容性和非侵入性地支持生物活性的球状蛋白的结合的可能性。
在这项工作中，我们描述了通过拆分内含肽介导的蛋白转拼反应及其应用作为蛋白质固定支架（ 图1）形成一种新的蛋白质凝胶的发展。此水凝胶的积木两种蛋白嵌段共聚物各自包含一个分裂的内含肽（IN和IC）和多聚体交联蛋白质的亚单位的N-或C-末端片段。该DnaE内含肽自念珠藻punctiforme（NPU）用作分割内含肽2,3和一个小的三聚体蛋白（12 kDa）的来自激烈热 CUTA horikoshii </ em>的用作交联剂蛋白4,5。不同的交联剂，通过内含肽催化的转拼反应结合，导致了高交联的蛋白网络（水凝胶）的形成。 NPU内含肽的选择，因为它的快速反应动力学（T 1/2 = 63秒）和高反式剪接率（接近80％）2,3。该CUTA蛋白被选为由于其高稳定性的交联剂。 CUTA三聚物具有接近150℃的变性温度，并保持三聚体四级结构中含有多达5个M盐酸胍4,6的解决方案。由于不同的交联剂亚基之间交换的物理水凝胶表面糜烂7的主要贡献者，在CUTA很强的亚基间相互作用应该阻止这种亚基的交流，从而导致更稳定的水凝胶。一这些积木还含有高度亲水的肽的S-片段作为中间嵌段，以促进水保留8。
两种水凝胶积木混合发起内含肽片段的IN和集成电路之间的转拼反应，生成一个较长的多肽链中与交联剂在两个终端。由多个这样的分子单元的交联剂彼此相互作用，从而形成高度交联的水凝胶网络（ 图1A）。一个具体的“基座肽”（DSP）掺入水凝胶的基石之一，以促进一个“对接蛋白”（DP）-标记的目标蛋白质为水凝胶的稳定固定。使用一个分裂内含肽介导的水凝胶组件不仅提供了用于蛋白质合成的水凝胶的额外的灵活性，但也可以使目标蛋白质的高密度，均匀的载荷在整个水凝胶，作为目标蛋白质前的水凝胶形成的装载。
内含肽介导的蛋白的水凝胶是高度站ble在水溶液中有小到没有3个月室温后检测的侵蚀。稳定性被保持在一个宽范围的pH（6-10）和温度（4-50℃），并在水凝胶也与有机溶剂相容。这样的水凝胶可用于双球状蛋白质的固定化：绿色荧光蛋白（GFP）和辣根过氧化物酶（HRP）。水凝胶包埋后者蛋白用于在有机溶剂中进行生物催化。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项工作中，我们展示了一个高度稳定的内含肽介导的蛋白水凝胶的合成。使用一个分裂内蛋白使得能够有条件地形成响应于两个液相成分混合的水凝胶。具体而言，分割内含肽共价连接两个液相积木通过转拼反应，得到交联单元，反过来自我组装成水凝胶两侧的多肽单元。混合诱导形成水凝胶的旁路中的单组分蛋白质凝胶，其中的色谱纯化柱的凝胶介导的堵塞可能发生的合成技术困难?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢大卫·蒂雷尔博士（加州理工学院）的盛情质粒的礼物pQE9交流10 ATRP 12，汤姆·缪尔博士（普林斯顿大学）的盛情质粒KanR表- IntRBS-NpuNC-CFN 11的礼物，松田武久博士（技术，白山市，石川，日本金泽大学）的盛情质粒PET30-CUTA -提示1 10，博士和杰伊·D·基斯林（加州大学伯克利）的盛情质粒的礼物pJD757 13的礼物。这项工作是由美国国家科学基金会职业，美国空军叶和诺曼·哈克曼高级研究计划中的一部分支持。
Materials
|
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
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