インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成
Summary
当社は、分割インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質の共重合体である。二つのタンパク質の共重合体の混合は、ヒドロゲルに自己組織化ペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガします。このヒドロゲルは、有機溶媒に対応して、高度なpHおよび温度安定性であり、簡単に機能的な球状タンパク質が組み込まれています。
Abstract
当社は、分割インテイン触媒によるタンパク質トランススプライシング反応によって媒介性の高い安定なタンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。親水性の高いランダムコイルは、保水性ブロックコポリマーの1つに挿入される。 2タンパク質のブロックコポリマーの混合は両端に架橋剤とペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガするヒドロゲルに急速に自己集合。このヒドロゲルは、酸性および塩基性の両方の条件下で、50°Cまでの温度で、有機溶媒中で非常に安定である。せん断誘発の破裂後のヒドロゲルは、急速な改革。ヒドロゲルビルディングブロックに「ドッキングステーションペプチド」の組み込みは、「ドッキングタンパク「タグ化標的タンパク質の簡便な取り込みを可能にする。ヒドロゲルは、組織培養増殖培地と互換性のある20 kDaの分子の拡散をサポートし、生物活性球状タンパク質の固定化を可能にする。有機溶媒適合性、生体触媒としてインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの適用は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素をカプセル化し、その活性を確証することによって実証された。
Introduction
タンパク質の全く作らヒドロゲルは大幅に組織工学、薬物送達およびbiofabrication 1のように多様な分野を進める可能性を運ぶ。彼らは、生体適合性と非侵襲的に生体活性球状タンパク質の取り込みをサポートするための可能性を含め、従来の合成高分子ヒドロゲルを上回る利点を提供します。
本研究では、分割インテイン媒介タンパク質トランス-スプライシング反応およびタンパク質固定足場（ 図1）としてのその適用を介して形成された新規タンパク質、ヒドロゲルの開発を記載している。このヒドロゲルのためのビルディングブロックは、各々が（INおよびIC）を分割インテインおよび多量体タンパク質の架橋サブユニットのN-またはC-末端断片を含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。のDnaEはインテノストックパンクチ （NPU）から<ホリコシパイロコッカスから2,3インテ分割し、小さなトリマータンパク質（12 kDa）のCutAとして使用された/全角>は架橋タンパク質4,5として使用した。異なる架橋剤は高度に架橋されたタンパク質ネットワーク（ハイドロゲル）の形成を導く、インテイン触媒によるトランス – スプライシング反応を介して接合されている。 NPUのインテインは、その高速な反応速度（T 1/2 = 63秒）、高トランススプライシング利回り（近い80％） の2,3の選ばれた。 CutAタンパク質は、その高い安定性のために、架橋剤として選ばれた。 CutAトリマーは、近い150℃の変性温度を持っているし、できるだけ多くのM 5として塩酸グアニジン4,6を含む溶液中で三量体四次構造を保持する。異なる架橋剤間のサブユニット交換は、物理的なハイドロゲル表面侵食7の主要な原因であることから、CutA非常に強い間、サブユニットの相互作用は、より安定したヒドロゲルにつながるようなサブユニットの交換を阻止する必要があります。これらのビルディングブロックの一つは、水を容易にするために、中間ブロックとして親水性の高いS-ペプチド断片を含むリテンション8。
2ヒドロゲルのビルディングブロックの混合は、両末端に架橋剤と、より長いポリペプチド鎖を生成し、フラグメントインテインINとICの間のトランス-スプライシング反応を開始する。複数のそのような分子単位の架橋剤は、高度に架橋されたヒドロゲル網目構造（ 図1A）を形成し 、互いに相互作用する。特定の「ドッキングステーションペプチド」（DSP）「ドッキングタンパク質」（DP）の安定な固定化を容易にするために、ヒドロゲル構成要素の1つに組み込まれているタグ化標的タンパク質へのヒドロゲル。のみならず、ヒドロゲルアセンブリを媒介するインテイン分割の使用は、タンパク質、ヒドロゲル合成のための追加の柔軟性を提供するだけでなく、標的タンパク質前ヒドロゲル形成にロードされるように、全体ヒドロゲルを通して標的タンパク質の高密度で均一な充填を可能にする。
インテイン媒介タンパク質ハイドロゲルは非常に安定である室温で3ヶ月後のリトル·ツー·検出可能な浸食と、水溶液中のBLE。安定性のpH（6-10）および温度（4-50℃）の広い範囲内に保持し、ヒドロゲルはまた、有機溶媒と適合性である。緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）：このヒドロゲルは2つの球状タンパク質の固定化のために使用される。後者のタンパク質を捕捉するヒドロゲルを有機溶媒に生体触媒を実行するために使用される。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、安定性の高いインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を示した。分割の使用は、条件付きインテインつの液相の成分の混合に対応して形成されるヒドロゲルを可能にする。具体的には、分割インテイン共有結合ターンでヒドロゲルに自己アセンブル単位を架橋することにより隣接されるポリペプチドユニットを得、 トランス -スプライシング反応を介して2つの液相の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、プラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFNは11の彼の種類のギフト用プラスミドpQE9交流10 ATRP 12、博士トム·ミューア（プリンストン大学）の彼の種類のギフトのためのデビッドTirrell（カリフォルニア工科大学）を承認したいと思いますプラスミドの彼の種類のギフトpJD757 13用プラスミドたpET30-CutA-TIP1 10、博士ジェイD.キースリング（UCバークレー）の彼の種類のギフトのための博士武久松田（テクノロジー、白山、石川県の金沢工業大学） 。この作品は、全米科学財団キャリア、米国空軍YIPとノーマン·ハックマン先進研究プログラムによって部分的にサポートされていました。
Materials
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Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
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