ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга

Summary

Этот протокол описан новый механический способ измельчения, что позволяет расширение сферических нервных стволовых и клеток-предшественников агрегатов без диссоциации к суспензии отдельных клеток. Поддержание клеток / клеток контакт позволяет быстро и стабильный рост на протяжении более 40 пассажей.

Abstract

Методика расширения ячейки, чтобы накопить большое количество клеток из одного образца для научных экспериментов и клинических испытаний значительно обогатило бы стволовых клеток сообщество. Многие методы текущие расширения являются трудоемкими и дорогостоящими, и тех, которые связаны полной диссоциации может вызвать несколько стволовые и клеток-предшественников типы пройти дифференциации или рано старение. Для преодоления этих проблем, мы разработали автоматизированную механическую метод пассажей называют "рубить", что является простым и недорогим. Этот метод позволяет избежать химической или ферментативной диссоциации на отдельные клетки и вместо этого позволяет масштабного расширения взвешенных, сфероидных культур, которые поддерживают постоянный контакт клеток / клеток. Способ измельчения имеет в основном были использованы для мозга плода, полученных нейронных клеток-предшественников или нейросферах, и недавно был опубликован для использования с нервных стволовых клеток, полученных из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Процедура увлеченностиэс посева нейросферы на культуре ткани чашки Петри, а затем передавая резкий, стерильный нож через клетки эффективно автоматизировать утомительный процесс вручную механически диссоциации каждую сферу. Приостановка клеток в культуре создает благоприятную соотношении между площадью поверхности к объему; как более 500000 клетки могут быть выращены в пределах одного нейросфера менее 0,5 мм в диаметре. В одном T175 колбу, более 50 миллионов клетки могут расти в суспензионных культур по сравнению с только 15 миллионов в прикрепленных культур. Важно отметить, что рубить процедура использовалась в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ), что позволяет массовое производство количество продуктов клинико-класса клеток.

Introduction

Существует долгая история расширения грызунов нервные стволовые клетки в культуре или как монослоя ^1-3 или совокупных нейросферы ^4-7. Кроме того, человека нервные клетки-предшественники (hNPCs), выделенные из различных регионов развивающегося центральной нервной системы ^8-17 были расширены в пробирке. Эти клетки являются би-мощным, способны дифференцироваться в обоих астроцитов и нейронов и были очень полезный инструмент в изучении развития нервной системы ^18,19 и болезни механизм ^20,21. hNPCs также пересадить в различных животных моделях заболеваний центральной нервной системы с различными уровнями интеграции, выживание и функциональных эффектов ^22-24.

Традиционно, грызун или фетальных НПС человека подвергаются воздействию факторов роста – часто эпидермальный фактор роста (EGF) и / или фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) ^25-28 – и как липкое, так и ²⁹ три-Мерные системы сферические, как правило, пассировать с помощью ферментативной диссоциации в одной клеточной суспензии ^30-34. Стандартный метод расширить клетки для исследований или клинического применения является как приверженец монослоя из-за легкого манипулирования. Тем не менее, мы показали, что пассажи однослойные и нейросфера hNPCs с ферментативных или химических растворов привело в начале старения ^35. Кроме того, ферментативной диссоциации может привести к повышению уровня дифференцировки и кариотипа аномалий на основе данных продемонстрированы с эмбриональными стволовыми клетками ^36-38. Хотя стандартный метод пассажей hNPCs выпустил текущий надлежащей производственной практики (цГМФ) класса продуктов, которые прошли в фазе 1 клинических испытаний (стволовые клетки Inc, Neuralstem Инк), метод разрешается только несколько раундов амплификации клетки, ограничивая банковские потенциал.

Очевидно, что крупные научно-исследовательские эксперименты и будущие клинические испытания могут воспользоваться возможностьюраспространяются клеток в натуральном и с задержкой старения, способствующих росту масштабную и сотовый банкинга. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали новый и автоматизированный способ механически пассажей неповрежденных нейросферы по "рубить" их в малых кластеров поддерживать клетки к клетке контакт. Этот метод значительно увеличить их срок службы ³⁹ и суспензионной культуры позволяет более эффективно использовать пространство инкубатора по сравнению с однослойных культур, как видно с альтернативным методом 3D биореактор культуры ^40. При условии, протокол измельчения позволяет для производства крупномасштабных банков от одного плода образца больше, чем канал 10, маловероятного подвиг, используя стандартные методы пассажей. Хотя этот метод для пассажи hNPCs является нетрадиционным, она растет в популярности, и был недавно, опубликованные с другими типами клеток, таких как нервные стволовые клетки, полученные из человеческих эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, что позволяет крупномасштабных расширение для различных приложений, включая возможность в версииИтро моделирование болезнь ^41-46. Важно отметить, что цГМФ-класс hNPC банк клеток уже производится с помощью метода разделочную, демонстрируя, что метод может быть применен к будущим клинического применения.

Protocol

1. Этические себе и безопасность Эта процедура включает в себя использование продуктов клеточных культур, полученных от человека или животных. Все полученные ткани должны быть утверждены до использования соответствующей Institutional Review Board (ы) и / или уходу и использованию животных ко…

Representative Results

Рисунок 5. Представительства данных.) Прогнозируемые количества клеток из hNPCs замораживают при p19, затем оттаивают и расширена как приверженец монослоя с помощью ферментативной диссоциации …

Discussion

Рисунок 6. Разделочные Схематическое. Расширение клетки сфероид стволовых / предшественники в культуре с использованием метода механической разделочную.

Критические шаги </p…

Materials

Beaker, 50 mL	Fisherbrand	FB-100-50	multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II	Baker	SG-603A	4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep	Personna	74-0002	multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts	Eppendorf	5810 R	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mL	Fisherbrand	S50712	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mL	BD Falcon	352074	multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer	Planer	Kryo 750	multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mL	Corning	430488	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5	BD Falcon	353107	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25	BD Falcon	353081	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175	BD Falcon	353045	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75	BD Falcon	353110	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L	Millipore	SCGPU11RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL	Millipore	SCGVU01RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL	Millipore	SCGPU05RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL	Millipore	SCGP00525	multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles	Whatman/GE	1001-085
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm	Fine Science Tools	11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
Incubator, 37°C/5% CO2	Forma	370 series	multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase	Hausser Scientific	1475	multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper	Lafayette Instruments	TC752-PD	Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1 – 10 μL	Gilson	F144562	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16"	Steritool	10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged	Fisherbrand	13-678-8B	multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable	Corning	3160-100
Pipet Aid	Drummond	4-000-101	multiple manufacturers/suppliers
Shim disc	McMaster-Carr	VARIABLE	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μL	AvantGuard	AV10R-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL	AvantGuard	AV1000	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μL	AvantGuard	AV20-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μL	AvantGuard	AV200-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL	Fisherbrand	13-676-10J	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL	Fisherbrand	13-675-3C	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL	Fisherbrand	13-676-10K	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL	Fisherbrand	13-676-10H	multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm	Crosstex	SCL	multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm	BD Falcon	351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way	Fisherbrand	03-448-17
Water Bath	Fisherbrand	S52602Q	multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline)	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore	GF316	multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	Millipore	LIF1010	multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1X)	Life Technologies	12563-011