Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

Summary

Este protocolo descreve um método de desbastamento mecânico novela que permite a expansão de células progenitoras e estaminais neurais agregados esféricos sem dissociação de uma única suspensão de células. Manter contato célula / célula permite um crescimento rápido e estável por mais de 40 passagens.

Abstract

A técnica de expansão de células de acumular um grande número de células a partir de uma única amostra para experimentos de pesquisa e ensaios clínicos beneficiariam muito a comunidade de células-tronco. Muitos métodos de expansão atuais são trabalhoso e caro, e os que envolvem a dissociação completa pode causar vários tipos de tronco e células progenitoras se submeter a diferenciação ou senescência precoce. Para superar estes problemas, foi desenvolvido um método de passagens em mecânico automatizado designado por "picar" que é simples e barato. Esta técnica evita a dissociação química ou enzimática em células individuais e em vez permite a expansão em grande escala de culturas em suspensão, esferóides que mantêm contacto célula / célula constante. O método de cortar tem sido principalmente utilizado para células progenitoras fetais derivadas do cérebro neurais ou neuroesferas, e, recentemente, tem sido publicado para utilização com as células estaminais neurais derivadas de células estaminais embrionárias pluripotentes e induzidos. O processo envolvendoes semeando neurospheres em uma cultura de tecidos de Petri e, posteriormente, de passagem, uma lâmina afiada estéril através das células efetivamente automatizando o processo tedioso de manualmente dissociar mecanicamente cada esfera. Suspender as células em cultura proporciona uma relação de superfície favorável área para volume; como mais de 500.000 células podem ser cultivadas num único neuroesfera de menos de 0,5 mm de diâmetro. Em um balão T175, mais de 50 milhões de células podem crescer em culturas de suspensão em comparação com apenas 15 milhões em culturas aderentes. É importante ressaltar que o processo de corte tem sido utilizado com uma corrente de boas práticas de fabricação (cGMP), permitindo a produção em quantidade em massa de produtos celulares clínica grau.

Introduction

Há uma longa história de expansão de células-tronco neurais de roedores na cultura tanto como uma monocamada ^1-3 ou ^4-7 neurospheres agregados. Além disso, as células progenitoras neurais humanas (hNPCs) isolados a partir de várias regiões do sistema nervoso central em desenvolvimento ^8-17 foram expandidas in vitro. Estas células são bi-potente, capaz de se diferenciar em ambos os astrócitos e neurônios e tem sido uma ferramenta muito útil no estudo do desenvolvimento neural ^18,19 e doença mecanismo ^20,21. hNPCs também têm sido transplantados em diversos modelos animais diferentes de doenças do sistema nervoso central, com diferentes níveis de integração, de sobrevivência e de efeitos funcionais ^22-24.

Tradicionalmente, o roedor ou NPCs fetais derivadas de humanos são expostas a factores de crescimento – factor de crescimento epidérmico, muitas vezes (EGF) e / ou fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2) ^25-28 – e ambos aderente ²⁹ e trêsSistemas de esferóides-dimensionais são tipicamente repicadas utilizando dissociação enzimática numa suspensão de células individuais ^30-34. O método padrão para expandir as células para a pesquisa ou uso clínico é como uma monocamada aderente devido à manipulação fácil. No entanto, temos mostrado que monocamada passaging e neuroesferas hNPCs com enzimática ou soluções químicas resultou em senescência precoce ^35. Além disso, a dissociação enzimática pode resultar em níveis aumentados de diferenciação e alterações cariotípicas com base em dados demonstrados com células estaminais embrionárias ^36-38. Embora o método padrão de hNPCs Passaging produziu atual boas práticas de fabrico (GMP) produtos de qualidade que passaram para a fase 1 de ensaios clínicos (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), o método permitiu apenas algumas rodadas de amplificação celular, limitando a potencial bancário.

Claramente, as grandes experiências de pesquisa e ensaios clínicos futuros poderiam se beneficiar da capacidade depropagar células a granel e com a senescência tardia para permitir o crescimento em grande escala e bancos de células. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma maneira nova e automatizada de neurospheres intactas Passaging mecanicamente por "cortar" os em pequenos grupos para manter contato célula-célula. Este método aumentou grandemente o seu tempo de vida e ³⁹ de suspensão de cultura permite uma utilização mais eficiente do espaço da incubadora em comparação com as culturas de monocamada, como pode ser visto com um método de cultura de biorreactor 3D alternativa ^40. O protocolo de desbastamento fornecida permite a produção de grandes bancos de uma amostra fetal maior do que a passagem 10, uma tarefa pouco provável usando métodos Passaging padrão. Enquanto este método para hNPCs Passaging é pouco convencional, que está crescendo em popularidade e foi recentemente publicado com outros tipos de células, como as células-tronco neurais derivadas de embriões humanos e células-tronco pluripotentes induzidas, permitindo a expansão em grande escala para várias aplicações, incluindo em vmodelagem de doenças ITRO ^41-46. Importante, uma cGMP-grau hNPC banco de células já foi produzida com o método de corte, o que demonstra que a técnica pode ser aplicada para aplicações clínicas futuras.

Protocol

1. Declaração de Segurança e Ética Este procedimento envolve a utilização de produtos de cultura de células derivadas a partir de seres humanos ou animais. Todos os tecidos derivados devem ser aprovados antes do uso pelo Conselho de Revisão Institucional apropriado (s) e / ou Animal Care e Use Comitê Institucional (s). Todos os resíduos bio-perigosos devem ser eliminados de acordo com as normas de segurança decididas pela respectiva instituição. Conhecer e seguir todas as orientações …

Representative Results

Número de células Figura 5. Dados representativos. A) Projeção de hNPCs congelados a p19, depois descongelado e expandida como uma monocamada aderente usando dissociação enzimática em comparação com neurospheres subculturas através do método de cortar. Dia 0 representa quando as células foram descongeladas a p20. B) Imagens r…

Discussion

Figura 6. Chopping esquemática. Expansão de células-tronco esferóide / progenitoras em cultura utilizando o método de corte mecânico.

Etapas críticas

Uma visão geral sobre o paradigma expansão corte é mostrado na Figura 6. Tamanho esfera hNPC é um dos critérios importa…

Materials

Beaker, 50 mL	Fisherbrand	FB-100-50	multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II	Baker	SG-603A	4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep	Personna	74-0002	multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts	Eppendorf	5810 R	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mL	Fisherbrand	S50712	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mL	BD Falcon	352074	multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer	Planer	Kryo 750	multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mL	Corning	430488	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5	BD Falcon	353107	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25	BD Falcon	353081	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175	BD Falcon	353045	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75	BD Falcon	353110	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L	Millipore	SCGPU11RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL	Millipore	SCGVU01RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL	Millipore	SCGPU05RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL	Millipore	SCGP00525	multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles	Whatman/GE	1001-085
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm	Fine Science Tools	11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
Incubator, 37°C/5% CO2	Forma	370 series	multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase	Hausser Scientific	1475	multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper	Lafayette Instruments	TC752-PD	Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1 – 10 μL	Gilson	F144562	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16"	Steritool	10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged	Fisherbrand	13-678-8B	multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable	Corning	3160-100
Pipet Aid	Drummond	4-000-101	multiple manufacturers/suppliers
Shim disc	McMaster-Carr	VARIABLE	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μL	AvantGuard	AV10R-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL	AvantGuard	AV1000	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μL	AvantGuard	AV20-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μL	AvantGuard	AV200-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL	Fisherbrand	13-676-10J	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL	Fisherbrand	13-675-3C	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL	Fisherbrand	13-676-10K	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL	Fisherbrand	13-676-10H	multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm	Crosstex	SCL	multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm	BD Falcon	351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way	Fisherbrand	03-448-17
Water Bath	Fisherbrand	S52602Q	multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline)	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore	GF316	multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	Millipore	LIF1010	multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1X)	Life Technologies	12563-011