Une méthode d'extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

Summary

Ce protocole décrit un procédé de découpage mécanique nouvelle qui permet l'expansion de souches et de cellules progénitrices neurales agrégats sphériques sans dissociation d'une suspension cellulaire unique. Maintenir le contact cellule / cellule permet une croissance rapide et stable depuis plus de 40 passages.

Abstract

Une technique d'expansion cellulaire d'amasser un grand nombre de cellules à partir d'un seul échantillon pour des expériences de recherche et d'essais cliniques bénéficierait grandement de la communauté sur les cellules souches. De nombreuses méthodes d'expansion actuels sont laborieuses et coûteuses, et ceux qui impliquent la dissociation complète peuvent provoquer plusieurs types de souches et de cellules progénitrices à subir une différenciation ou la sénescence précoce. Pour surmonter ces problèmes, nous avons mis au point une méthode de repiquage mécanique automatisé dénommé "hachage" qui est simple et peu coûteux. Cette technique évite la dissociation chimique ou enzymatique dans les cellules simples et place permet l'expansion à grande échelle de suspension, cultures sphéroïde qui maintiennent le contact cellule / cellule constante. Le procédé de hachage a été utilisée principalement pour les cellules cérébrales fœtales dérivé progénitrices neurales ou des neurosphères, et a été récemment publiée pour une utilisation avec des cellules souches neurales dérivées de cellules souches embryonnaires pluripotentes et induits. La procédure impliquantes semis neurosphères sur une culture de tissu boîte de Pétri, puis en passant une lame tranchante, stérile à travers les cellules automatiser efficacement le processus fastidieux de la main dissocier mécaniquement chaque sphère. Mise en suspension des cellules en culture fournit une surface rapport favorable surface sur volume; que plus de 500 000 cellules peuvent être cultivées dans un seul neurosphères de moins de 0,5 mm de diamètre. Dans un flacon T175, plus de 50 millions de cellules peuvent se développer dans des cultures en suspension contre seulement 15 millions en cultures adhérentes. Surtout, la procédure de hachage a été utilisé dans les bonnes pratiques de fabrication (cGMP), permettant la production de la quantité de masse de produits de cellules de qualité clinique.

Introduction

Il ya une longue histoire de l'expansion des cellules souches neurales rongeurs en culture soit une monocouche ^1-3 ou ^4-7 neurosphères globales. En outre, les cellules progénitrices neurales humaines (hNPCs) isolés à partir de différentes régions du développement du système nerveux central ^8-17 ont été élargies in vitro. Ces cellules sont bi-puissant, capable de se différencier en astrocytes et les neurones les deux et ont été un outil très utile pour étudier le développement neural ^18,19 et ^20,21 mécanisme maladie. hNPCs ont également été transplantées dans de nombreux modèles de la maladie du système nerveux central des animaux différents avec différents niveaux d'intégration, à la survie et les effets fonctionnels ^22-24.

Traditionnellement, les rongeurs ou NPC foetales humaines dérivées sont exposés à des facteurs de croissance épidermique – souvent facteur de croissance (EGF) et / ou le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2) et ^{25 à 28} – ²⁹ à la fois adhérent et troisSystèmes de sphéroïdes dimensions sont généralement soumises à des passages en utilisant la dissociation enzymatique dans une suspension à cellule unique ^30-34. La méthode standard pour développer des cellules pour la recherche ou l'utilisation clinique est comme une monocouche adhérente raison d'une manipulation facile. Cependant, nous avons montré que des passages monocouches et neurosphères hNPCs avec des solutions chimiques ou enzymatiques ont donné lieu à la sénescence précoce ^35. En outre, la dissociation enzymatique peut entraîner une augmentation des niveaux de différenciation et des anomalies caryotypiques d'après les données démontré avec des cellules souches embryonnaires ^{de 36 à 38.} Bien que la méthode standard de hNPCs de passages a produit les bonnes pratiques de fabrication (BPF) des produits de qualité qui sont passés en phase 1 des essais cliniques (cellules souches Inc., Neuralstem Inc.), la méthode autorisée seulement quelques cycles d'amplification cellulaire, ce qui limite la potentiel bancaire.

De toute évidence, les grandes expériences de recherche et d'essais cliniques futurs pourraient bénéficier de la capacité depropager des cellules en vrac et à la sénescence retardée pour permettre la croissance à grande échelle et de banques de cellules. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une façon nouvelle et automatisé de neurosphères intactes mécaniquement passages par "couper" en petits groupes pour maintenir le contact de cellule à cellule. Ce procédé augmente considérablement leur durée de vie et la culture en suspension ³⁹ permet une utilisation plus efficace de l'espace de l'incubateur par rapport aux cultures en monocouche, comme on le voit avec une méthode de culture 3D de bioréacteur alternatif ^40. Le protocole permet de hachage prévu pour la production de banques à grande échelle d'un échantillon foetal supérieur passage 10, un exploit peu probable en utilisant des procédés standards de repiquage. Bien que cette méthode pour hNPCs de repiquage n'est pas conventionnelle, il est de plus en plus en popularité et a été récemment publié avec d'autres types tels que les cellules souches neurales dérivées de l'embryon humain et les cellules souches pluripotentes induites cellulaires, permettant l'expansion à grande échelle pour diverses applications, notamment dans vITRO modélisation de la maladie ^41-46. Surtout, un hNPC banque de cellules cGMP de qualité a déjà été produit avec le procédé de hachage, ce qui démontre que la technique peut être appliquée à de futures applications cliniques.

Protocol

1. Déclaration et de la sécurité éthique Cette procédure implique l'utilisation de produits de la culture de cellules dérivées d'êtres humains ou d'animaux. Tous les tissus dérivés doivent être approuvées avant l'utilisation par le Conseil d'examen institutionnel approprié (s) et / ou le soin et l'utilisation des animaux Comité (s) institutionnelle. Tous les déchets biologiques dangereux doivent être éliminés conformément à la réglementation en matière d…

Representative Results

Le nombre de cellules Figure 5. Des données représentatives. A) prévues de hNPCs congelés à p19, puis décongelés et élargis comme monocouche adhérente utilisant dissociation enzymatique par rapport à neurosphères à des passages par la méthode de hachage. Jour 0 représente lorsque les cellules ont été décongelées à p20. B)</stro…

Discussion

Figure 6. Schéma découper. L'expansion des cellules souches du sphéroïde / progénitrices en culture selon la méthode de découpage mécanique.

Étapes critiques

Un aperçu du paradigme de l'expansion de coupe est représentée sur la figure 6. HNPC taille de la sphè…

Materials

Beaker, 50 mL	Fisherbrand	FB-100-50	multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II	Baker	SG-603A	4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep	Personna	74-0002	multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts	Eppendorf	5810 R	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mL	Fisherbrand	S50712	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mL	BD Falcon	352074	multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer	Planer	Kryo 750	multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mL	Corning	430488	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5	BD Falcon	353107	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25	BD Falcon	353081	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175	BD Falcon	353045	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75	BD Falcon	353110	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L	Millipore	SCGPU11RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL	Millipore	SCGVU01RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL	Millipore	SCGPU05RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL	Millipore	SCGP00525	multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles	Whatman/GE	1001-085
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm	Fine Science Tools	11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
Incubator, 37°C/5% CO2	Forma	370 series	multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase	Hausser Scientific	1475	multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper	Lafayette Instruments	TC752-PD	Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1 – 10 μL	Gilson	F144562	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16"	Steritool	10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged	Fisherbrand	13-678-8B	multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable	Corning	3160-100
Pipet Aid	Drummond	4-000-101	multiple manufacturers/suppliers
Shim disc	McMaster-Carr	VARIABLE	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μL	AvantGuard	AV10R-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL	AvantGuard	AV1000	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μL	AvantGuard	AV20-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μL	AvantGuard	AV200-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL	Fisherbrand	13-676-10J	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL	Fisherbrand	13-675-3C	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL	Fisherbrand	13-676-10K	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL	Fisherbrand	13-676-10H	multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm	Crosstex	SCL	multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm	BD Falcon	351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way	Fisherbrand	03-448-17
Water Bath	Fisherbrand	S52602Q	multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline)	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore	GF316	multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	Millipore	LIF1010	multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1X)	Life Technologies	12563-011