Denne protokol beskriver en ny mekanisk sønderdeling, der tillader udvidelse af sfæriske neurale stamceller og stamcelle aggregater uden dissociation til en enkelt cellesuspension. Fastholdelse af celle / celle kontakt giver mulighed for hurtig og stabil vækst i over 40 passager.
En celle ekspansion teknik til at samle et stort antal celler fra et enkelt eksemplar til forskningsprojekter eksperimenter og kliniske forsøg vil være til stor gavn stamceller samfund. Mange nuværende ekspansion metoder er besværlige og dyre, og dem, der involverer komplet dissociation kan forårsage flere stamceller og stamceller typer til at gennemgå differentiering eller tidlig ældning. For at overvinde disse problemer har vi udviklet en automatiseret mekanisk passage benævnt "hakke", der er enkel og billig metode. Denne teknik undgår kemisk eller enzymatisk dissociation i enkelte celler og i stedet giver mulighed for storstilet udvidelse af suspenderet, sfæroidpartikler kulturer, der opretholder konstant celle / celle kontakt. Snittemetoden er primært blevet anvendt til fostrets hjerne-afledte neurale stamceller eller neurosfærer, og er for nylig blevet udgivet til brug med neurale stamceller fra embryoner og induceret pluripotente stamceller. Proceduren beliges seeding neurosfærer på en vævskultur petriskål og efterfølgende passerer en skarp, steril kniv gennem cellerne effektivt automatisere kedelige processen med manuelt mekanisk adskille hver sfære. Suspension af celler i kultur giver et gunstigt overfladeareal-til-volumen-forhold; som over 500.000 celler kan dyrkes i en enkelt neurosfære på mindre end 0,5 mm i diameter. I en T175 kolbe, kan over 50 millioner celler vokser i suspensionskulturer i forhold til kun 15 millioner i vedhængende kulturer. Vigtigere er det, snitning procedure blevet brugt i henhold til gældende god fremstillingspraksis (cGMP), tillader masse mængde produktion af klinisk-grade celle produkter.
Der er en lang tradition for at udvide gnaver neurale stamceller i kultur som enten et monolag 1-3 eller aggregerede neurosfærer 4-7. Desuden har humane neurale stamceller (hNPCs) isoleret fra forskellige regioner i udviklingslandene centralnervesystemet 8-17 blevet udvidet in vitro. Disse celler er bi-potent, stand til at differentiere sig til både astrocytter og neuroner og har været et meget nyttigt værktøj i at studere neurale udvikling 18,19 og sygdom mekanisme 20,21. hNPCs er også blevet transplanteret ind i mange forskellige dyremodeller for sygdom i centralnervesystemet med varierende niveauer af integration, overlevelse og funktionelle virkninger 22-24.
Traditionelt er gnaver eller humane føtale afledt NPC udsættes for vækstfaktorer – ofte epidermal vækstfaktor (EGF) og / eller fibroblastvækstfaktor-2 (FGF-2) 25-28 – og både vedhæftende 29 og tre-Dimensionelle kugleformede systemer er typisk passage ved hjælp af enzymatisk dissociation i en enkelt-cellesuspension 30-34. Standarden metode til at udvide celler til forskning eller klinisk anvendelse er som tilhænger monolag på grund af let manipulation. Men vi har vist, at passage monolags og neurosfæreceller hNPCs med enzymatiske eller kemiske opløsninger resulterede i tidlig ældning 35.. Desuden kan enzymatisk dissociation resultere i forhøjede niveauer af differentiering og karyotypic abnormiteter baseret på data demonstreret med embryonale stamceller 36-38. Selv om standarden metode passaging hNPCs har produceret god fremstillingspraksis (cGMP) grade produkter, der er gået ind i fase 1 kliniske forsøg (Stamceller Inc., Neuralstem Inc.), den metode kun tilladt et par runder celleamplifikation, hvilket begrænser bank potentiale.
Det er klart, kan store forskningscentre eksperimenter og fremtidige kliniske forsøg drage fordel af muligheden for atudbrede celler i bulk og med forsinket senescens at tillade storstilet vækst og celle bankvirksomhed. For at imødekomme dette behov, har vi udviklet en ny og automatiseret måde mekanisk passaging intakte neurosfærer med "hakke" dem ind i små klynger for at opretholde celle-til-celle kontakt. Denne fremgangsmåde i høj grad øget deres levetid 39 og suspensionskultur tillader en mere effektiv udnyttelse af inkubator plads i forhold til monolag kulturer, som det ses med et alternativt 3D bioreaktor dyrkningsmetode 40. Den angivne hakke-protokollen giver mulighed for produktion af store banker fra en føtal prøve større end passage 10, en usandsynlig bedrift ved hjælp af standard passaging metoder. Selv om denne fremgangsmåde for passage hNPCs er utraditionel, det er stigende i popularitet, og blev for nylig offentliggjort med andre celletyper, såsom neurale stamceller fra humane embryonale og inducerede pluripotente stamceller, der gør det muligt i stor skala udvidelse til forskellige applikationer herunder vitro sygdom modellering 41-46. Vigtigere er det, har en cGMP-grade hNPC celle banken allerede er produceret med Snittemetoden, viser, at teknikken kan anvendes over for fremtidige kliniske anvendelser.
Figur 6.. Chopping Skematisk. Udvidelse klumpformet stamceller / stamceller i kultur ved hjælp af den mekaniske Snittemetoden.
Kritiske trin
En oversigt over snitning ekspansion paradigme er vist i figur 6.. HNPC sfære størrelse er en af de vigtige kriterier for at observere, f?…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Soshana Svendsen til kritisk gennemgang og redigering af denne rapport. Dette arbejde blev medvirket til af NIH / NINDS 1U24NS078370-01 og CIRM Dr2a-05320.
Beaker, 50 mL | Fisherbrand | FB-100-50 | multiple manufacturers/suppliers |
Bio-Safety Cabinet, class II | Baker | SG-603A | 4 ft. or 6 ft. model. 6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers |
Blades, Double-edge Prep | Personna | 74-0002 | multiple manufacturers/suppliers. CAUTION: Sharp |
Cell Freezing Media | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | DMSO, serum-free |
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts | Eppendorf | 5810 R | multiple manufacturers/suppliers |
Conical Tubes, 15 mL | Fisherbrand | S50712 | multiple manufacturers/suppliers |
Conical Tubes, 50 mL | BD Falcon | 352074 | multiple manufacturers/suppliers |
Controlled Rate Freezer | Planer | Kryo 750 | multiple manufacturers/suppliers |
Cryovials, 2 mL | Corning | 430488 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T12.5 | BD Falcon | 353107 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T25 | BD Falcon | 353081 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T175 | BD Falcon | 353045 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T75 | BD Falcon | 353110 | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L | Millipore | SCGPU11RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL | Millipore | SCGVU01RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL | Millipore | SCGPU05RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL | Millipore | SCGP00525 | multiple manufacturers/suppliers |
Filter Paper, 8.5 cm circles | Whatman/GE | 1001-085 | |
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm | Fine Science Tools | 11001-18 | |
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol | Nalgene | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
Incubator, 37°C/5% CO2 | Forma | 370 series | multiple manufacturers/suppliers |
Hemacytometer, Phase | Hausser Scientific | 1475 | multiple manufacturers/suppliers |
McIlwain Tissue Chopper | Lafayette Instruments | TC752-PD | Petri dish modification required. CAUTION: Moving, sharp blade. |
Micropipettor, 1 – 10 μL | Gilson | F144562 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" | Steritool | 10302 | |
Pasteur Pipets, cotton-plugged | Fisherbrand | 13-678-8B | multiple manufacturers/suppliers |
Petri Dish, Glass, Autoclavable | Corning | 3160-100 | |
Pipet Aid | Drummond | 4-000-101 | multiple manufacturers/suppliers |
Shim disc | McMaster-Carr | VARIABLE | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 10 μL | AvantGuard | AV10R-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL | AvantGuard | AV1000 | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 20 μL | AvantGuard | AV20-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 200 μL | AvantGuard | AV200-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL | Fisherbrand | 13-676-10J | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL | Fisherbrand | 13-675-3C | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL | Fisherbrand | 13-676-10K | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL | Fisherbrand | 13-676-10H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm | Crosstex | SCL | multiple manufacturers/suppliers |
Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | |
Tissue Culture Dishes, 60 mm | BD Falcon | 351007 | |
Tube Racks, Interlocking Four-Way | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Water Bath | Fisherbrand | S52602Q | multiple manufacturers/suppliers |
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents | |||
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) | Sigma-Aldrich | S3194-500ML | Important to use the Stemline brand |
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore | GF316 | multiple manufacturers/suppliers |
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | LIF1010 | multiple manufacturers/suppliers |
Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
TrypLE Select (1X) | Life Technologies | 12563-011 |