البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em> في المختبر</em> دراسة الأوعية الدموية
Summary
مقايسة تشكيل أنبوب هو، طريقة للقياس لقياس سريع في المختبر الأوعية الدموية. يتم الجمع بين الخلايا البطانية مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على استخراج الغشاء القاعدي. يحدث تشكيل أنبوب خلال ساعات والأنابيب التي شكلت حديثا كميا بسهولة.
Abstract
الأوعية الدموية هي عملية حيوية للتنمية الأنسجة الطبيعية والتئام الجروح، ولكن يرتبط أيضا مع مجموعة متنوعة من الحالات المرضية. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن قياس الأوعية الدموية في المختبر بطريقة سليمة وقابلة للقياس الكمي سريعة. يتم خلط الخلايا البطانية الأولية أو خلدت مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على مصفوفة الغشاء القاعدي. وتشكل الخلايا البطانية الشعرية مثل الهياكل استجابة لإشارات عائية وجدت في وسائل الإعلام مشروطة. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع الخلايا البطانية التي تبدأ لمواءمة أنفسهم في حدود 1 ساعة والأنابيب التي تحتوي على التجويف تبدأ في الظهور في غضون 2 ساعة. أنابيب يمكن تصور باستخدام المجهر المقلوب على النقيض المرحلة، أو الخلايا يمكن علاجها calcein AM مسبق للفحص والأنابيب من خلال تصور أو مضان المجهري متحد البؤر. عدد المواقع فرع / العقد، وأعمدة / تنسجم، أو عدد أو طول أنابيب شكلت يمكن قياسها كميا بسهولة كمقياس للفي vitrس الأوعية الدموية. وباختصار، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الجينات والمسالك التي تشارك في تعزيز أو تثبيط الأوعية الدموية بطريقة سريعة واستنساخه، والكمية.
Introduction
الأوعية الدموية، وتطوير أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة مسبقا، أمر حيوي لمجموعة متنوعة من العمليات بما في ذلك نمو الجهاز، التطور الجنيني، والتئام الجروح 1-3. وضعت حديثا الأوعية الدموية، واصطف بواسطة الخلايا البطانية، والأكسجين العرض والمواد المغذية إلى الأنسجة، وتعزيز المراقبة المناعة من الخلايا المكونة للدم وإزالة النفايات 2،4. الأوعية الدموية هي ذات أهمية رئيسية أثناء التطور الجنيني والجنين. ومع ذلك، لا تزال هذه العملية نائمة في البالغين إلا في أوقات التئام الجروح ونمو الهيكل العظمي، والحمل أو أثناء الدورة الشهرية 1-3.
على مدى العقدين الماضيين، بدأت الآليات الجزيئية الرئيسية التي تنظم الأوعية الدموية في الظهور. الأوعية الدموية هو حدث ينظم بإحكام، متوازنة من إشارات المؤيد والأوعية بما integrins، كيموكينات، angiopoietins، وكلاء الاستشعار الأوكسجين، جزيئات صلي ومثبطات الذاتية 5. مرة واحدة proangإشارات iogenic مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF)، وعامل نمو البشرة (EGF) تنشيط الخلايا البطانية مستقبلات الخلايا البطانية تطلق البروتياز للحط من الغشاء القاعدي. الخلايا البطانية ثم تتكاثر وتهاجر، وتشكيل براعم بمعدل عدة مليمترات في اليوم الواحد 6،7.
ويرتبط الأوعية الدموية مع مختلف الحالات المرضية بما فيها السرطان، والصدفية، واعتلال الشبكية السكري، والتهاب المفاصل، والربو، واضطرابات المناعة الذاتية والأمراض المعدية، وتصلب الشرايين 8-10. نظرا لأهمية الأوعية الدموية في أمراض مختلفة، فهم الجينات والمسارات التي تنظم هذه العملية أمر بالغ الأهمية لتصميم علاجات أفضل.
مقايسة تشكيل أنبوب هو طريقة سريعة والكمي لتحديد الجينات أو مسارات المشاركة في الأوعية الدموية. وصف لأول مرة في عام 1988،المبادئ التي تقوم عليها هذا الاختبار هي أن الخلايا البطانية تحتفظ القدرة على الانقسام وتهاجر بسرعة استجابة لإشارات عائية 11-13. علاوة على ذلك، وبفعل الخلايا البطانية للتمييز وتشكيل الهياكل أنبوب يشبه عندما مثقف على مصفوفة من استخراج الغشاء القاعدي (BME). هذه الأنابيب تحتوي على تجويف تحيط بها الخلايا البطانية ترتبط معا من خلال المجمعات صلي. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع معظم أنابيب تشكيل في هذا الاختبار في غضون 2-6 ساعة تبعا لكمية ونوع المثيرات عائية.
عدة أنواع من الخلايا البطانية يمكن استخدامها لهذا الاختبار بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط الخلايا خلد 14،15. كان خط الخلية المستخدمة لهذا المقال الماوس 3B-11، ولكن نفس منهجية يمكن تطبيقها مع خطوط أخرى مثل الخلايا البطانية SVEC4-10 (الماوس) أو الخلايا البطانية الأولية مثل HUVEC (الإنسان) الخلايا. تبعا الذي يستخدم خط الخلية وما إذا كانت البطانية متتحول LLS أو غير تحولت، سوف تحتاج الأمثل التي ستجرى لتحديد الوقت المثالي اللازمة لتشكيل أنبوب المناسب.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشارك الأوعية الدموية في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية. دراسة الآليات التي تشارك في تكوين الأوعية الدموية يتطلب استخدام المقايسات أن ألخص أهم الخطوات في الأوعية الدموية. والبطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ويقدم العديد من المزايا أكثر من فحوصات أخرى. فمن السهل أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث في جزء من برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان في المعاهد الوطنية للصحة، وNCI منح UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
