Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em> In Vitro</em> Studio di Angiogenesi
Summary
Il saggio di formazione del tubo è un metodo veloce e quantificabili per misurare l'angiogenesi in vitro. Le cellule endoteliali sono combinati con i media condizionati e piastrate su estratto di membrana basale. Formazione del tubo avviene entro ore e tubuli appena formati facilmente quantificabile.
Abstract
L'angiogenesi è un processo fondamentale per lo sviluppo del tessuto normale e la guarigione della ferita, ma è anche associato con una varietà di condizioni patologiche. Usando questo protocollo, l'angiogenesi può essere misurata in vitro in un veloce, modo quantificabile. Cellule endoteliali primarie o immortalati sono mescolati con i media condizionati e placcato su matrice membrana basale. Le cellule endoteliali formano strutture simili a capillari in risposta ai segnali angiogenici trovati in mezzi condizionati. La formazione del tubo avviene rapidamente con le cellule endoteliali cominciando ad allinearsi entro 1 ora e tubuli-lume contenente cominciando ad apparire in 2 ore. I tubi possono essere visualizzati con un contrasto di fase invertito microscopio, o le cellule possono essere trattate con calceina AM prima del test e tubi visualizzati tramite fluorescenza o confocale. Il numero di siti di filiale / nodi, loop / mesh, o il numero o la lunghezza dei tubi formati può essere facilmente quantificato in una misura di in vitro angiogenesi. In sintesi, questo test può essere utilizzato per identificare i geni e vie che sono coinvolti nella promozione o inibizione dell'angiogenesi in modo rapido, riproducibile, e quantitativa.
Introduction
L'angiogenesi, lo sviluppo di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti, è di vitale importanza per una varietà di processi tra cui la crescita di organi, lo sviluppo embrionale, e la guarigione delle ferite 1-3. Recentemente ha sviluppato i vasi sanguigni, rivestiti da cellule endoteliali, l'apporto di ossigeno e sostanze nutritive ai tessuti, promuovere la sorveglianza immunitaria da parte delle cellule ematopoietiche e rimuovere i prodotti di scarto 2,4. L'angiogenesi è di fondamentale importanza durante lo sviluppo embrionale e fetale. Tuttavia, questo processo rimane latente negli adulti eccetto durante i periodi di guarigione delle ferite, la crescita scheletrica, la gravidanza o durante il ciclo mestruale 1-3.
Negli ultimi due decenni, i meccanismi molecolari fondamentali che regolano l'angiogenesi hanno cominciato ad emergere. L'angiogenesi è un evento strettamente regolamentato, equilibrato per segnali pro e anti-angiogenici, tra cui integrine, chemochine, angiopoietine, agenti di rilevamento ossigeno, molecole giunzionali e inibitori endogeni 5. Una volta proangsegnali iogenic come la base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), fattore di crescita derivato piastrine (PDGF), e il fattore di crescita epidermico (EGF) attivano cellule endoteliali dei recettori delle cellule endoteliali rilasciano proteasi a degradare la membrana basale. Le cellule endoteliali poi proliferano e migrano, formando germogli a una velocità di alcuni millimetri al giorno 6,7.
L'angiogenesi è associata a varie condizioni patologiche, tra cui il cancro, la psoriasi, la retinopatia diabetica, artrite, asma, malattie autoimmuni, malattie infettive, e l'aterosclerosi 8-10. Data l'importanza dell'angiogenesi in varie malattie, la comprensione dei geni e vie che regolano questo processo è fondamentale per la progettazione di terapie migliori.
Il saggio di formazione del tubo è un metodo rapido e quantitativo per la determinazione geni o meccanismi coinvolti nell'angiogenesi. In primo luogo descritto nel 1988,i principi alla base di questa analisi sono che le cellule endoteliali mantengono la capacità di dividersi e migrare rapidamente in risposta ai segnali angiogenici 11-13. Inoltre, le cellule endoteliali vengono indotte a differenziarsi e formare strutture tubo-come quando coltivate su una matrice di estratto di membrana basale (BME). Questi tubi contengono un lume circondato da cellule endoteliali collegate tra loro attraverso complessi giunzionali. Formazione del tubo avviene rapidamente con la maggior parte dei tubi che formano in questo test entro 2-6 ore a seconda della quantità e del tipo di stimoli angiogenici.
Diversi tipi di cellule endoteliali possono essere usati per questo dosaggio compreso sia cellule primarie e linee cellulari immortalizzate 14,15. La linea cellulare utilizzata per questo articolo è stata del mouse 3B-11, ma la stessa metodologia può essere applicata con le altre linee di cellule endoteliali, come SVEC4-10 (topo) o cellule endoteliali primarie come le cellule umane (HUVEC). A seconda di quale linea cellulare è usato e se ce endotelialeLLS sono trasformati o non trasformati, l'ottimizzazione dovrà essere effettuata per identificare il momento ideale necessaria per la corretta formazione del tubo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'angiogenesi è coinvolta nei processi sia fisiologici e patologici. Studiare i meccanismi coinvolti nell'angiogenesi richiede l'uso di saggi che ricapitolano le principali fasi di angiogenesi. Il tubo cellule saggio di formazione endoteliali offre diversi vantaggi rispetto ad altri saggi. E 'facile set-up, è relativamente poco costoso, produce tubuli in poche ore, ed è quantificabile. Inoltre, esso può essere completato in 24 o 96 pozzetti piastre, e quindi può essere utilizzato per lo screening ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute presso il National Institutes of Health, e NCI concedere UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
