Эндотелия Формирование Анализ сотового трубка для<em> In Vitro</em> Изучение ангиогенеза
Summary
Анализ формирования трубка быстро, количественно метод измерения ангиогенеза в пробирке. Эндотелиальные клетки в сочетании с кондиционированной среды и высевали на чашки с экстрактом базальной мембраны. Формирование Tube происходит в течение нескольких часов и вновь образованные трубочки легко количественно.
Abstract
Ангиогенез является важным процессом для нормального развития тканей и заживления ран, но также связано с различными патологическими состояниями. Использование этого протокола, ангиогенез может быть измерена в пробирке в быстрой, количественно образом. Первичные или иммортализованных эндотелиальные клетки смешивают с кондиционированной среды и высевали на базальной мембраны матрицы. Эндотелиальные клетки образуют капиллярные структуры в ответ на ангиогенных сигналов, обнаруженных в кондиционированной среды. Формирование трубки быстро происходит с эндотелиальные клетки начинают присоединяются в 1 час и люмен содержащих трубочки начинают появляться в пределах 2 часов. Трубы могут быть визуализированы с помощью фазово-контрастного инвертированный микроскоп, или клетки могут быть обработаны кальцеина AM До анализа и труб визуализируется с помощью флуоресценции или конфокальной микроскопии. Ряд отраслевых сайтов / узлами, петли / сетки, или число или длина трубок, образованных можно легко количественно в качестве меры в ВИТРо ангиогенез. Таким образом, этот анализ может быть использован для идентификации генов и путей, которые участвуют в развитии или ингибирования ангиогенеза в быстром, воспроизводимым и количественном выражении.
Introduction
Ангиогенеза, развитие новых кровеносных сосудов из существующих ранее сосудов, имеет жизненно важное значение для различных процессов, включая рост органов, эмбриональное развитие и ранозаживляющее 1-3. Недавно разработанный кровеносные сосуды, выстлана эндотелиальные клетки, подача кислорода и питательных веществ к тканям, повышает иммунный контроль по гемопоэтических клеток и удаления отходов продуктов 2,4. Ангиогенез имеет ключевое значение во время развития эмбриона и плода. Тем не менее, этот процесс остается в состоянии покоя у взрослых, кроме во время заживления ран, рост скелета, беременности или во время менструального цикла 1-3.
За последние два десятилетия, ключевые молекулярные механизмы, которые регулируют ангиогенез начали появляться. Ангиогенеза является жестко регулируется событие, уравновешивается за и антиангиогенных сигналов, включая интегринов, хемокинов, ангиопоэтинам, агентов зондирования кислорода, соединительных молекул и эндогенных ингибиторов 5. После proangiogenic сигналы, такие как основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), и эпидермального фактора роста (EGF) активировать рецепторы эндотелиальных клеток эндотелиальные клетки высвобождают протеазы, чтобы ухудшить базальную мембрану. Эндотелиальные клетки затем пролиферируют и мигрируют, образуя побеги со скоростью несколько миллиметров в день 6,7.
Ангиогенез связан с различными патологическими состояниями, включая рак, псориаз, диабетической ретинопатии, артрит, астма, аутоиммунные заболевания, инфекционные заболевания, атеросклероза и 8-10. В связи с важностью ангиогенеза при различных заболеваниях, понимая гены и пути, которые регулируют этот процесс решающее значение для разработки более совершенных терапии.
Анализ формирования трубки является быстрым и количественный метод определения генов или путей, вовлеченных в ангиогенез. Впервые описан в 1988 году,принципы, лежащие в основе этого анализа, что эндотелиальные клетки сохраняют способность к делению и быстро мигрировать в ответ на ангиогенных сигналов 11-13. Кроме того, эндотелиальные клетки индуцированы к дифференцировке и образуют трубки, как структуры, при культивировании на матрице экстракта базальной мембраны (BME). Эти трубки содержат просвет, окруженный эндотелиальных клеток, связанных между собой через соединительных комплексов. Формирование трубы быстро происходит с большинством трубок, образующих в этом анализе в течение 2-6 ч в зависимости от количества и типа ангиогенных стимулов.
Несколько типов эндотелиальных клеток могут быть использованы для этого анализа, включая как первичные клетки и иммортализованных клеточных линий 14,15. Клеточная линия используется для этой статьи была мышь 3B-11, но та же самая методика может применяться с другими эндотелиальных клеточных линий, таких как SVEC4-10 (мыши) или первичных эндотелиальных клеток, таких как HUVEC клеток (человека). В зависимости от клеточной линии используется ли и эндотелиальной CEзаполняет преобразуются или нетрансформированных, оптимизации должны быть проведены, чтобы определить идеальное время, необходимое для правильного формирования трубки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ангиогенез вовлечен в обоих физиологических и патологических процессов. Изучение механизмов, участвующих в ангиогенезе требуется использование анализов, которые воспроизводят основные этапы ангиогенеза. Эндотелия формирование анализ клеток трубка имеет ряд преимуществ перед друг?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано частично исследовательской программы Intramural Национального института рака при Национальном институте здоровья, и по NCI предоставить UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
