Endothelial Cell Tube Formation Assay voor de<em> In Vitro</em> Studie Angiogenese
Summary
De buisvorming assay is een snelle, meetbare werkwijze voor het meten in vitro angiogenese. Endotheelcellen worden gecombineerd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan extract. Tube vorming gebeurt binnen enkele uren en nieuw gevormde buisjes gemakkelijk gekwantificeerd.
Abstract
Angiogenese is een belangrijke werkwijze voor normale ontwikkeling weefsel en wondgenezing, maar wordt ook geassocieerd met een verscheidenheid aan pathologische aandoeningen. Met dit protocol kan angiogenese worden gemeten in vitro in een snelle, kwantificeerbare wijze. Primaire of geïmmortaliseerde endotheel cellen gemengd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan matrix. De endotheliale cellen vormen capillaire structuren in reactie op angiogene signalen in geconditioneerd medium. De buis formatie optreedt snel met endotheelcellen beginnen zich aan te sluiten binnen 1 uur en-lumen met buisjes beginnen te verschijnen binnen 2 uur. Buizen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een fase-contrast omgekeerde microscoop, of de cellen worden behandeld met calceïne AM vóór de assay en pijpen gevisualiseerd door fluorescentie of confocale microscopie. Het aantal filialen / nodes, lussen / meshes of het aantal of lengte van buizen gevormde gemakkelijk worden gekwantificeerd als maat in vitro angiogenese. Samenvattend, kan deze test gebruikt worden om genen en routes die betrokken zijn bij de bevordering of remming van angiogenese in een snelle, reproduceerbare en kwantitatieve wijze identificeren.
Introduction
Angiogenese, de ontwikkeling van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande schepen, is essentieel voor een verscheidenheid van werkwijzen waaronder orgaangroei, embryonale ontwikkeling en wondgenezing 1-3. Nieuw ontwikkelde bloedvaten, bekleed met endotheelcellen, toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar weefsels bevorderen immuunbewaking door hematopoietische cellen en afvoer van afvalproducten 2,4. Angiogenese is van groot belang tijdens de embryonale en foetale ontwikkeling. Dit proces blijft slapende in de volwassen behalve in tijden van wondheling, skeletopbouw, zwangerschap of tijdens de menstruele cyclus 1-3.
In de afgelopen twee decennia de belangrijkste moleculaire mechanismen die angiogenese reguleren zijn begonnen te ontstaan. Angiogenese is een strak gereguleerde evenement, in evenwicht gehouden door pro-en anti-angiogene signalen waaronder integrines, chemokines, angiopoietinen, zuurstof sensing agenten, junctionele moleculen en endogene remmers 5. Zodra proangiogenic signalen zoals basis fibroblast groeifactor (bFGF), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), en epidermale groeifactor (EGF) activeert endotheliale celreceptoren de endotheelcellen proteasen de basale membraan degraderen. De endotheelcellen vervolgens prolifereren en migreren, die kiemen met een snelheid van enkele millimeters per dag 6,7.
Angiogenese is geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen zoals kanker, psoriasis, diabetische retinopathie, artritis, astma, auto-immuunziekten, infectieziekten en atherosclerose 8-10. Vanwege het belang van angiogenese in verschillende ziekten, het begrijpen van de genen en pathways die regelen dit proces is cruciaal voor de ontwikkeling van een beter therapeutica.
De buisvorming assay is een snelle en kwantitatieve werkwijze voor het bepalen van genen of routes die betrokken zijn bij angiogenese. Voor het eerst beschreven in 1988,de uitgangspunten van deze test zijn dat endotheelcellen behouden de mogelijkheid om te delen en snel migreren naar aanleiding van angiogene signalen 11-13. Verder worden endotheelcellen geïnduceerd te differentiëren en vormen buisvormige structuren indien gekweekt op een matrix van basaal membraan extract (BME). Deze buizen bevatten een lumen omringd door endotheelcellen elkaar verbonden door junctional complexen. Tube vorming gebeurt snel met de meeste buizen vormen in deze test binnen 2-6 uur, afhankelijk van de hoeveelheid en de aard van de angiogene stimuli.
Verschillende soorten endotheelcellen kan voor deze test zowel primaire cellen geïmmortaliseerde cellijnen 14,15. De cellijn die voor dit artikel was mouse 3B-11, maar dezelfde methode kan worden toegepast met andere endotheliale cellijnen zoals SVEC4-10 (muis) of primaire endotheelcellen zoals HUVEC (humane) cellen. Afhankelijk van de cellijn wordt gebruikt en of de endotheliale cells worden omgezet of niet-getransformeerde, zal optimalisatie moeten worden uitgevoerd om de ideale tijd nodig voor een goede vaatvorming identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenese is betrokken bij zowel de fysiologische en pathologische processen. Bestuderen mechanismen betrokken bij angiogenese vereist het gebruik van testen die de belangrijkste stappen in angiogenese recapituleren. De endotheelcel vaatvorming assay biedt verscheidene voordelen boven andere assays. Het is gemakkelijk op te zetten, is relatief goedkoop, produceert buisjes binnen enkele uren, en is meetbaar. Verder kan in 24-of 96-well platen voltooid en kan dus worden gebruikt voor high throughput screening om factore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Cancer Institute van de National Institutes of Health, en door het NCI verlenen UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
