Endothelial Cell Tube Dannelse Assay for<em> In Vitro</em> Study of Angiogenese

Summary

Røret dannelse analysen er en rask, kvantifiserbare metode for å måle in vitro angiogenese. Endotelceller er kombinert med kondisjonert media og sådd ut på basalmembran ekstrakt. Tube dannelsen oppstår i løpet av timer og nydannede tubuli lett kvantifisert.

Abstract

Angiogenese er en viktig prosess for normalt vev utvikling og sårheling, men er også forbundet med en rekke patologiske tilstander. Ved hjelp av denne protokollen, kan angiogenese kan måles in vitro i en rask, kvantifiserbar måte. Primære eller udødeliggjorte endotelceller er blandet med kondisjonert media og sådd ut på basalmembran matrise. De danner kapillære endotelceller lignende strukturer som reaksjon på angiogene signaler som finnes i betingede media. Røret dannelsen skjer raskt med endotelceller begynner å justere seg selv innen 1 time og lumen holdige tubuli begynner å dukke opp i løpet av 2 timer. Rør kan visualiseres ved hjelp av et fasekontrast invertert mikroskop, eller cellene kan behandles med calcein AM forut for analysen og rør visualisert ved fluorescens eller konfokal mikroskopi. Antallet grensider / noder, slep / maskene, eller antallet eller lengden av rør som dannes kan lett bli kvantifisert som et mål på in vitro angiogenese. I sammendrag, kan denne analysen anvendes for å identifisere gener og trasé som er involvert i å fremme eller inhibering av angiogenese i en rask, reproduserbar og kvantitativ måte.

Introduction

Angiogenese, utvikling av nye blodkar fra hatt kontakt fartøyer, er viktig for en rekke prosesser, inkludert organveksten, embryoutvikling, sårheling og ^1-3. Nyutviklet blodkar, omgitt av endotelceller, gi oksygen og næringsstoffer til vev, fremme immun overvåking av blodkreft cellene og fjerner avfallsstoffer ^2,4. Angiogenese er av sentral betydning under embryonal og fosterutvikling. Imidlertid gjenstår denne prosessen sovende i voksen unntatt i tider med sårtilheling, skjelettvekst, graviditet eller i løpet av menstruasjonssyklusen ^1-3.

I løpet av de siste to tiårene, har viktige molekylære mekanismer som regulerer angiogenese begynt å dukke opp. Angiogenese er et tett regulert hendelse, balansert med pro og antiangiogenic signaler inkludert inte, kjemokiner, angiopoietins, oksygen sensing agenter, junctional molekyler og endogene hemmere ^fem. Når proangiogenic signaler som basis fibroblast vekstfaktor (bFGF), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) og epidermal vekstfaktor (EGF) aktivere endotelial cellereseptorer endotelceller frigi proteaser å nedbryter basalmembraner. Endotelceller deretter spre seg og migrere, danner spirer med en hastighet på flere millimeter per dag ^6,7.

Angiogenese er forbundet med forskjellige patologiske tilstander, inkludert kreft, psoriasis, diabetisk retinopati, artritt, astma, autoimmune sykdommer, infeksjonssykdommer og aterosklerose ^8-10. På grunn av viktigheten av angiogenese i forskjellige sykdommer, forstå gener og trasé som regulerer denne prosessen er kritisk for utforming av bedre terapeutika.

Røret dannelse analysen er rask og kvantitativ metode for bestemmelse av gener eller veier som er involvert i angiogenese. Først beskrevet i 1988,prinsippene denne analysen er at endotelceller beholder evnen til å dele seg og migrere raskt i respons til angiogenetiske signaler ^11-13. Videre er endotelceller induseres til å differensiere og danne rør-lignende strukturer når dyrket på en matrise av basalmembran-ekstrakt (BME). Disse rørene inneholder en lumen omgitt av endotelceller knyttet sammen gjennom junctional komplekser. Tube dannelse skjer raskt med de fleste rør som danner i denne analysen innen 2-6 timer, avhengig av mengde og type av angiogene stimuli.

Flere typer av endotelceller kan anvendes for denne analysen inkludert både primærceller og udødeliggjorte cellelinjer ^14,15. Den cellelinje som brukes for denne artikkelen ble mus 3B-11, men den samme metode kan brukes med andre endotel-cellelinjer så som SVEC4-10 (mus) eller primære endotelceller som HUVEC (humane) celler. Avhengig av hvilken cellelinje som brukes, og hvorvidt endotel-ceLLS er transformert eller ikke-transformerte, vil optimalisering må gjennomføres for å identifisere den ideelle tiden som er nødvendig for riktig røret formasjon.

Protocol

1. Innsamling av kondisjonerte medie å teste for angiogenetiske Potential Grow primære eller udødeliggjorte celler til å bli testet for angiogent eller antiangiogene potensial i native eller lave serum media og samle den betingede media. Alternativt bruk kondisjonerte media umiddelbart, eller alikvoteres og lagres ved -80 ° C i flere måneder. Bruk nonconditioned opprinnelig lavt eller serum-mediet som en negativ kontroll, og bruker ikke-betinget komplett vekstmedium (10% FBS, eller passende kon…

Representative Results

Mus 3B-11 endoteliale celler ble utsådd på størknede reduserte vekstfaktor BME – i denne analysen, ble produktet Matrigel anvendes – og fulgt over tid. Som vist i figur 1, angiogene faktorer utskilt av enten mus keratinocytter eller fibroblaster er i stand til å indusere dannelsen rør over tid. Endotelceller migrere og begynner å danne små greiner innen 1-2 timer av platekledning. Maksimal tube formasjonen ble nådd med 4-6 timers hjelp betingede media tidligere innhentet fra keratinocytter. Ved …

Discussion

Angiogenese er involvert i både fysiologiske og patologiske prosesser. Studerer mekanismene som er involvert i angiogenese krever bruk av analysene som rekapitulere de viktigste trinnene i angiogenese. Den endotelcelle røret dannelse assay tilbyr flere fordeler i forhold til andre analyser. Det er lett å sette opp, er relativt billig, produserer tubuli i løpet av timer, og er kvantifiserbare. Videre kan det være ferdig i 24- eller 96-brønners plater, og kan således brukes for høy throughput screening for å iden…

Materials

Item	Manufacturer	Catalog #
Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate	Corning	3524
BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-Glutamine 200mM (100X)	Life Technologies	25030-081
Gibco Pen Strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1X)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1X)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X