Endotelcell Tube Formation analys för<em> In Vitro</em> Studie av angiogenes
Summary
Röret bildningsanalys är en snabb, kvantifierbar metod för att mäta in vitro angiogenes. Endotelceller kombineras med konditionerat medium och ströks ut på basalmembranextraktet. Tube bildningen sker inom timmar och nybildade tubuli lätt kvantifieras.
Abstract
Angiogenes är en viktig process för normal vävnadsutveckling och sårläkning men är också associerad med en mängd olika patologiska tillstånd. Med hjälp av detta protokoll, får angiogenes mätas in vitro på ett snabbt, mätbart sätt. Primära eller odödliggjorda endotelceller blandas med konditionerade medier och pläterade på basalmembranmatris. De endotelceller bildar kapillär liknande strukturer som svar på angiogena signaler som finns i konditionerade medier. Röret bildningen sker snabbt med endotelceller börjar anpassa sig inom 1 timme och lumen innehållande tubuli börjar dyka inom 2 tim. Rör kan visualiseras med användning av ett faskontrast inverterat mikroskop, eller cellerna kan behandlas med kalcein AM före analysen och rören visualiseras genom fluorescens eller konfokalmikroskopi. Antalet filialplatser / noder, slingor / maskor, eller antal eller längd rör bildas lätt kan kvantifieras som ett mått på i VITRo angiogenes. Sammanfattningsvis kan denna analys användas för att identifiera gener och signalvägar som är involverade i att främja eller hämning av angiogenes i en snabb, reproducerbar, och kvantitativt sätt.
Introduction
Angiogenes, utvecklingen av nya blodkärl från redan existerande kärl, är avgörande för en mängd olika processer inklusive organtillväxt, embryonal utveckling och sårläkning 1-3. Nyutvecklad blodkärl, kantade av endotelceller, utbud syre och näringsämnen till vävnader, främja immunövervakning av hematopoetiska celler och tar bort slaggprodukter 2,4. Angiogenes är av central betydelse under embryots och fostrets utveckling. Men denna process förblir vilande i den vuxna utom under tider av sårläkning, skelettillväxt, graviditet eller under menstruationscykeln 1-3.
Under de senaste två decennierna har viktiga molekylära mekanismer som reglerar angiogenes börjat växa fram. Angiogenes är en hårt reglerad händelse, viktad pro och antiangiogena signaler inklusive integriner, kemokiner, angiopoietins, syrekännande medel, Junktional molekyler och endogena inhibitorer 5. När proangiogenic signaler såsom basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF) och epidermal tillväxtfaktor (EGF) aktivera endotelceller receptorer endotelcellerna frisätta proteaser för att bryta ned basalmembranet. Endotelcellerna proliferera sedan och migrerar och bildar groddar med en hastighet av flera millimeter per dag 6,7.
Angiogenes är associerad med olika patologiska tillstånd, inklusive cancer, psoriasis, diabetisk retinopati, artrit, astma, autoimmuna sjukdomar, infektionssjukdomar och ateroskleros 8-10. På grund av betydelsen av angiogenes i olika sjukdomar, förstå de gener och signalvägar som reglerar denna process är kritisk för utformning av bättre terapeutiska medel.
Röret bildningsanalys är en snabb och kvantitativ metod för bestämning av gener eller reaktionsvägar som är involverade i angiogenes. Först beskrivs i 1988,principerna denna analys är att endotelceller bibehåller förmågan att dela sig och migrera snabbt svar på angiogena signaler 11-13. Vidare är endotelceller induceras för att differentiera och bilda rörliknande strukturer när odlade på en matris av basalmembranextrakt (BME). Dessa rör innehåller en lumen omgiven av endotelceller kopplas samman genom junctionala komplex. Tube bildningen sker snabbt med de flesta rör bildar i denna analys inom 2-6 h beroende på mängd och typ av angiogena stimuli.
Flera typer av endotelceller kan användas för denna analys, inklusive både primära celler och immortaliserade cellinjer 14,15. Den cellinje som används för den här artikeln var mus 3B-11, men samma metod kan tillämpas med andra endotelceller cellinjer såsom SVEC4-10 (mus) eller primära endotelceller såsom HUVEC (mänskliga) celler. Beroende på vilken cellinje används och huruvida endothelial cells omvandlas eller icke-transformerade, kommer optimerings måste genomföras för att identifiera den perfekta tiden behövs för korrekt rörbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenes är involverad i både fysiologiska och patologiska processer. Att studera mekanismer som är inblandade i angiogenes kräver användning av analyser som rekapitulera de viktigaste stegen i angiogenes. Den endotelcell röret bildningsanalys erbjuder flera fördelar jämfört med andra analyser. Det är lätt att ställa upp, är relativt billig, producerar tubuli inom några timmar, och är kvantifierbara. Vidare kan det fyllas i 24- eller 96-brunnars plattor, och kan således användas för high throughput s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds delvis av Interna Research Program för National Cancer Institute vid National Institutes of Health, och NCI bevilja UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
