AFM-baserede Kortlægning af de elastiske egenskaber af cellevægge: ved Tissue, Cellular, og Subcellulære resolutioner

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

Vi beskriver en nyligt udviklet fremgangsmåde til at måle mekaniske egenskaber af overfladen af ​​plantevæv ved hjælp af atomic force mikroskopi (AFM) mikro / nano-indsnit, til JPK AFM. Konkret i denne protokol vi måler den tilsyneladende Youngs modul af cellevægge ved subcellulære beslutninger på tværs af regioner på op til 100 um x 100 um i blomstret meristems, hypokotyler, og rødder. Det kræver omhyggelig forberedelse af prøven, det korrekte valg af mikro-Indenters og indrykning dybder. At redegøre for cellevægs egenskaber kun er målinger udført i stærkt koncentrerede opløsninger af mannitol for at plasmolyze cellerne og dermed fjerne bidrag celle saftspændingen.

I modsætning til andre bevarede teknikker, ved hjælp af forskellige Indenters og indrykning dybder, denne metode giver mulighed for samtidig multiscale målinger <em> Dvs ved subcellulære resolutioner og på tværs af hundredvis af celler, der omfatter et væv. Dette betyder, at det nu er muligt at rumligt tidsmæssigt karakterisere de ændringer, der finder sted i de mekaniske egenskaber af cellevægge under udviklingen, således at disse ændringer korreleres med vækst og differentiering. Dette er et afgørende skridt for at forstå, hvordan koordinerede mikroskopiske cellulære ændringer medføre makroskopiske morfogenetiske begivenheder.

Men flere begrænsninger er fortsat: metoden kan kun bruges på forholdsvis små prøver (ca. 100 um i diameter), og kun på eksterne væv; fremgangsmåden er følsom over for væv topografi; den måler kun visse aspekter af væv komplekse mekaniske egenskaber. Teknikken udvikles hurtigt, og det er sandsynligt, at de fleste af disse begrænsninger vil blive løst i den nærmeste fremtid.

Introduction

Væksten i planter opnås ved koordineret udvidelse af de stive cellevægge, der omgiver hver celle af organismen. Akkumulerende tyder på, at det er gennem en ændring af cellevæggen kemi, planter lokalt styre denne ekspansion. Udvidelsen menes primært at være drevet af belastning af cellevæggene, forårsaget af cellen høje saftspændingen; denne stamme respons på saftspændingen er underlagt de mekaniske egenskaber af cellevæggene ^1. Lidt er kendt af disse mekaniske egenskaber, og hvordan de ændrer sig under udvikling. Endvidere lidt er kendt, hvordan disse mekaniske egenskaber er kontrolleret og om feedback bidrage til at ændre cellevæg kemi på en måde, at der åbenbart er koordineret på en væv. Hvis vi skal forstå sammenhængen mellem kemiske og mekaniske ændringer i planternes cellevægge under udviklingen, og i sidste ende, hvordan disse mikroskopiske interaktioner styrer en plante'S makroskopisk vækst, en metode, der kan overvåge mekaniske egenskaber af cellevægge i udviklingslandene organer på celler eller væv skala er påkrævet.

Atomic force mikroskopi (AFM), der er beskrevet her, som er baseret på mikrometer eller nanometer væv kompressioner eller fordybninger, blev udviklet præcist at måle de mekaniske egenskaber af cellevægge i udviklingslandene organer samtidigt på subcellulære opløsninger og på tværs af hele regioner i væv. Andre metoder har enten en opløsning, der er for lav eller for høj: extensometerets er kun i stand til at måle de gennemsnitlige mekaniske egenskaber af en hel væv ved millimeter skala ^2-4, en skala, der er for eksempel for stor til at måle tidlige hændelser i organogenesis; den microindenter kan tage målinger på subcellulære opløsning på nanometer skala, men den er begrænset til måling af isolerede celler og ikke grupper af celler eller organer ^5-7. Med AFM, den kræverd væv, cellulære og subcellulære resolutioner kan opnås ^8-10. For nylig flere protokoller er blevet udviklet specielt til at måle mekanik af planter væv, der også kan benyttes ^{11, 12.}

Vi præsenterer her, hvordan man vurderer elasticitet af væv gennem måling af den tilsyneladende Youngs modul ^13.

The Young modul er almindeligt anvendt til at beskrive stivheden af ​​et materiale. Under lille deformation den nødvendige kraft til at deformere et materiale er proportional med arealet af indrykning. The Young modul er denne koefficient. I tilfælde af en kontinuerlig homogent materiale vil blive målt samme koefficient uanset indrykningen type (størrelse og form), men vil ændre sig med hastigheden af ​​målingen. I tilfælde af den komplekse struktur af planter væv, har vi observeret, så langt, at kraften er proportional med deformation tillader bestemmelse afen koefficient på proportionalitet, som vi kalder "tilsyneladende ung modul". I kontrast fra kontinuerlige medier i anlæggene, denne tilsyneladende unge modul er følsom over for størrelsen af ​​indrykning. Det svarer ikke til den unge moduli af en ren cellevæg. Det bedst beskriver elasticiteten af ​​stilladser af cellevæggen af ​​vævet.

Protocol

1.. Forbered glas Slides til montering Sample Forbered imbedding agarose medier: 0,7% lavtsmeltende agarose i 10% mannitol (i vand). Anvendelse af en stærk metal-instrument (f.eks borespids, lime), etch en 0,5 x 0,5 cm område i centrum af et mikroskopi objektglas. Eller i stedet, lim et lille stykke glas lameller (ca. 20 x 200 um) til objektglas ved hjælp af Araldite lim. BEMÆRK: Denne roughens overfladen for at lette vedhæftning af agarose at sikre, at agarose medier pinde eller rette…

Representative Results

I figur 1 præsenterer vi typiske Unge moduli kort over blomstermotiver meristems (figur 1A og 1B), unge og gamle hypokotyler (figur 1C-F), og rod meristem (figur 1G og 1H). I alle eksperimenter indrykning er halvkugleformet, men dens radius er forskellig, således at forskellige geografiske opløsninger kan opnås Figurerne 1C og 1D viser typiske resultater for meso-nanoskala Indenters…

Discussion

I planter spiller skiftende mekaniske egenskaber en stor rolle i at lede vækst og morfogenese. Til dato har der været store fremskridt i at udrede de genetiske og kemiske netværk, der styrer planternes vækst, men vores viden om, hvordan disse netværk bidrager til og er påvirket af ændringer i mekaniske egenskaber er rudimentære. Denne metode skal gøre det muligt for os at udfylde dette hul, og så bør det være af stor interesse for forskere studerer ethvert aspekt af plantevækst eller morfogenese. Vi har nu …

Materials

AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope
Stereo Microscopes	Leica	M125	Any type of stereo microscopes could do.
150nm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use
1µm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis
Tipless cantiliver	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	TL-NCH-20	to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver
5µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Aradilte	Bartik S.A. 77170 Coubet France		Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver
low melting Agarows	Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410	BP160-100	34-45 Gelation Temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)	M4125-500G
2  Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland	951199