AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
We beschrijven een recent ontwikkelde methode om de mechanische eigenschappen van de oppervlakken van plantenweefsels meten met behulp van atomic force microscopie (AFM) micro / nano-indrukkingen, een JPK AFM. Specifiek, in dit protocol meten we de schijnbare elasticiteitsmodulus van celwanden op subcellulaire resoluties in regio tot 100 urn x 100 urn in floral meristemen, hypocotylen en wortels. Dit vereist een zorgvuldige voorbereiding van het monster, de juiste keuze van micro-indringlichamen en inspringen diepten. Ter compensatie celwand eigenschappen alleen worden metingen uitgevoerd in sterk geconcentreerde oplossingen van mannitol teneinde de cellen plasmolyze en aldus verwijder de bijdrage van cel turgor.
In tegenstelling tot andere bestaande technieken door verschillende indringlichamen en inspringing diepte, deze werkwijze maakt gelijktijdige meerschalige metingen <em> Dat wil zeggen op subcellulaire resoluties en over honderden cellen die een weefsel. Dit betekent dat het nu mogelijk om ruimtelijk-tijdelijk kenmerken de veranderingen die plaatsvinden in de mechanische eigenschappen van celwanden tijdens de ontwikkeling, waardoor deze veranderingen gecorreleerd met de groei en differentiatie. Dit is een belangrijke stap om te begrijpen hoe gecoördineerde microscopische cellulaire veranderingen teweegbrengen macroscopische morfogenetische gebeurtenissen.
Echter, een aantal beperkingen blijven: de methode kan alleen gebruikt worden op relatief kleine monsters (ongeveer 100 urn in diameter) en slechts externe weefsels; de methode is gevoelig weefsel topografie; het meet slechts bepaalde aspecten van complexe mechanische eigenschappen van het weefsel. De techniek wordt snel ontwikkeld en het is waarschijnlijk dat de meeste van deze beperkingen in de nabije toekomst zal worden opgelost.
Introduction
De groei van planten wordt bereikt door gecoördineerde expansie van de starre celwanden dat elke cel van het organisme omringen. Accumuleren bewijsmateriaal wijst erop dat het door de wijziging van de celwand chemie die planten lokaal te bedienen deze uitbreiding. De uitbreiding wordt verondersteld primair gedreven door druk op de celwanden, veroorzaakt door hoge turgor van de cel; deze stam reactie op turgor wordt beheerst door de mechanische eigenschappen van de celwanden 1. Er is weinig bekend van deze mechanische eigenschappen en hoe ze veranderen tijdens de ontwikkeling. Verder weinig bekend over hoe deze mechanische eigenschappen worden gecontroleerd en of feedbacks bijdragen tot celwand chemie veranderen op een wijze die blijkbaar gecoördineerd tussen een tissue. Als we het verband tussen chemische en mechanische veranderingen in de celwanden van planten tijdens de ontwikkeling, en uiteindelijk hoe deze microscopische interacties regeren een plant te begrijpen'S macroscopische groei, een werkwijze die de mechanische eigenschappen van de celwand in ontwikkelende organen in de cellen of weefsels schaal kan controleren vereist.
Werkwijze atomaire kracht microscopie (AFM) beschreven, die gebaseerd is op micrometer of nanometer weefsel compressie of inkepingen, werd berekend dat de mechanische eigenschappen van de celwand in ontwikkelende organen gelijktijdig op subcellulaire resoluties en over de gehele regio weefsel meten. Andere methoden hebben een resolutie die is te laag of te hoog: de extensometer is alleen in staat om de gemiddelde mechanische eigenschappen van een hele weefsel meten op de millimeter schaal 2-4, een schaal die is bijvoorbeeld te groot om vroege gebeurtenissen in meten organogenese; de microindenter kunnen verrichten van metingen bij subcellulaire resolutie op de nanometer schaal, maar het is beperkt tot het meten van geïsoleerde cellen en geen groepen van cellen of organen 5-7. Bij de AFM, de eisend weefsel, cellulair en subcellulaire resoluties kan worden bereikt 8-10. Onlangs hebben verschillende protocollen zijn speciaal ontwikkeld voor de monteurs planten weefsel dat ook kan worden gebruikt 11, 12 gemeten.
We zullen hier voor te stellen hoe de elasticiteit van het weefsel te evalueren door meting van de schijnbare Young's modulus 13.
De Young modulus wordt vaak gebruikt om de stijfheid van een materiaal beschrijft. Tijdens kleine vervorming de vereiste kracht vervormen materiaal is evenredig met de oppervlakte van inkeping. De Young modulus is deze coëfficiënt. Bij een continu homogeen materiaal dezelfde coëfficiënt ongeacht de verdieping soort (grootte en vorm) worden gemeten, maar verandert met de snelheid van de meting. Voor de complexe structuur van planten weefsel, hebben we tot nu toe dat de kracht evenredig is met de vervorming waardoor de bepaling van de waargenomeneen coëfficiënt van evenredigheid dat we de naam "schijnbare jonge modulus". In contrast met continue media in de planten, deze schijnbare modulus jonge gevoelig is voor de grootte van de indrukking. Het komt niet overeen met de jonge moduli van een zuivere celwand. Het beschrijft het beste de elasticiteit van de steigers van de cel-wand van het weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
In planten, het veranderen van de mechanische eigenschappen een belangrijke rol spelen in het sturen van de groei en morfogenese. Tot op heden is er grote vooruitgang geboekt in het ontrafelen van de genetische en chemische netwerken die de groei van planten onder controle is geweest, maar onze kennis van hoe deze netwerken dragen bij aan en worden beïnvloed door veranderingen in de mechanische eigenschappen is rudimentair. Deze methode moet ons in staat stellen om deze leemte op te vullen, en dus is het van groot bela…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij geven speciale dank aan Yves Couder voor vele nuttige discussies. Wij danken Atef Asnacios voor de kalibratie van de uitkragingen en discussie. Wij danken Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, en Oliver Hamant voor kritisch lezen. Dit werk werd deels gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie RGP0062/2005-C; de Agence Nationale de la Recherche projecten'' Growpec,'' en'' Mechastem''.
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
References
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
