Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

Nós descrevemos um método recentemente desenvolvido para medir as propriedades mecânicas das superfícies dos tecidos vegetais através de microscopia de força atômica (AFM) micro / nano-recuos, para um JPK AFM. Especificamente, neste protocolo medimos o módulo de Young aparente das paredes celulares em resoluções subcelulares em todas as regiões de até 100 mm x 100 mm em meristemas florais, hipocótilos e raízes. Isto requer uma preparação cuidadosa da amostra, a correta seleção de micro-penetradores e profundidades recuo. Para ter em conta as propriedades da parede celular só, as medições são realizadas em soluções altamente concentradas de manitol de modo a plasmolyze as células e, assim, remover a contribuição da pressão de turgescência celular.

Em contraste com outras técnicas existentes, por meio de diferentes penetradores e profundidades de entalhe, este método permite a medição simultânea multiscale, <em> Ou seja em resoluções subcelulares e em centenas de células que compõem um tecido. Isso significa que agora é possível caracterizar espacialmente temporalmente as mudanças que ocorrem nas propriedades mecânicas da parede celular durante o desenvolvimento, permitindo que essas alterações sejam correlacionados com o crescimento e diferenciação. Isto representa um passo fundamental para compreender como as alterações celulares microscópicas coordenados trazer eventos morfogenéticos macroscópicos.

No entanto, várias limitações permanecem: o método pode ser usado apenas em relativamente pequenas amostras (cerca de 100 um de diâmetro) e apenas em tecidos externos; o método é sensível à topografia do tecido; ele mede apenas certos aspectos das propriedades mecânicas complexas do tecido. A técnica está a ser desenvolvida rapidamente e é provável que a maioria destas limitações sejam ultrapassadas em breve.

Introduction

Crescimento em plantas é conseguido pela expansão coordenada das paredes celulares rígidas que cercam cada uma e todas as células do organismo. Acumulando evidência indica que é através da modificação química da parede celular de plantas que controlar localmente essa expansão. A expansão é pensado para ser conduzido principalmente por pressão sobre as paredes das células, provocadas por uma elevada pressão de turgescência da célula; esta resposta de tensão para a pressão de turgescência é governada pelas propriedades mecânicas das paredes das células ^1. Pouco se sabe sobre estas propriedades mecânicas e como eles mudam durante o desenvolvimento. Além disso, pouco se sabe sobre a forma como estas propriedades mecânicas são controlados e se opiniões contribuir para alterar a química da parede celular de um modo que aparentemente é coordenado através de um tecido. Se quisermos compreender a relação entre as alterações químicas e mecânicas na parede celular das plantas durante o desenvolvimento e, finalmente, como essas interações microscópicas governar uma plantaO crescimento macroscópico, um método que pode controlar as propriedades mecânicas das paredes das células no desenvolvimento de órgãos à escala celular ou de tecido é necessária.

O método de microscopia de força atómica (AFM), descrito aqui, o qual é baseado em micrométricas ou nanométricas compressões de tecidos ou cavidades, foi desenvolvido para medir com precisão as características mecânicas de paredes celulares no desenvolvimento de órgãos simultaneamente com resoluções subcelulares e entre as regiões inteiras de tecido. Outros métodos têm uma resolução que é muito baixo ou muito alto: o extensômetro só é capaz de medir as propriedades mecânicas médias de um tecido inteiro na escala milimétrica ^2-4, numa escala que é, por exemplo muito grande para medir os primeiros eventos organogênese; o microindenter pode fazer medições em resolução subcelular em escala nanométrica, mas é restrita a medição células isoladas e não grupos de células ou órgãos ^5-7. Com a AFM, a exigirtecido d, celulares e subcelulares resoluções podem ser alcançados ^8-10. Recentemente, vários protocolos têm sido desenvolvidos especificamente para medir mecânica do tecido de plantas que também poderiam ser utilizados ^{11, 12.}

Vamos apresentar aqui como avaliar a elasticidade do tecido através da medição do módulo aparente de Young ^13.

O módulo de elasticidade é utilizada para descrever a rigidez de um material. Durante a pequena deformação a força necessária para deformar um material é proporcional à área de reentrância. O módulo de Young é este coeficiente. No caso de um material homogéneo contínuo com o mesmo coeficiente será medido, independentemente do tipo de recuo (tamanho e forma) mas mudará com a velocidade da medição. No caso de a estrutura complexa do tecido de plantas, temos observado até agora que a força é proporcional à deformação, permitindo a determinação deum coeficiente de proporcionalidade que chamamos "jovem módulo aparente". Em contraste a partir de meios contínuos nas plantas, este novo módulo aparente é sensível ao tamanho do recuo. Ele não corresponde ao novo módulos de uma parede celular puro. Ela descreve melhor a elasticidade do andaime da parede celular do tecido de.

Protocol

1. Prepare lâminas de vidro para montagem Amostra Prepare encaixar mídia agarose: 0,7% de agarose de baixa fusão em 10% manitol (em água). Usando um instrumento de metal forte (por exemplo, ponta broca, cal), gravar uma área de 0,5 x 0,5 cm no centro de uma lâmina de vidro de microscopia. Ou em vez disso, colar um pequeno pedaço de lamela de vidro (cerca de 20 x 200 mm) para a lâmina de vidro com cola Araldite. NOTA: Este encrespa a superfície, a fim de facilitar a aderência da ca…

Representative Results

Na Figura 1 apresenta-se típicas Jovens mapas de módulos de meristemas florais (Figuras 1a e 1b), jovens e velhos hipocotiledonar (Figuras 1C-F) e meristema da raiz (Figura 1G e 1H). Em todos os experimentos o penetrador é hemisférica, mas seu raio é diferente, de modo que diferentes resoluções espaciais podem ser alcançados Figuras 1C e 1D mostram resultados típicos para penetradores meso-esca…

Discussion

Nas plantas, a mudança de propriedades mecânicas desempenham um papel importante na orientação do crescimento e morfogénese. Até à data, tem havido um grande progresso em desvendar as redes genéticas e químicas que controlam o crescimento das plantas, mas nosso conhecimento de como essas redes contribuem e são afetadas por mudanças nas propriedades mecânicas é rudimentar. Este método deve permitir-nos para preencher esta lacuna, e por isso deve ser de grande interesse para os cientistas que estudam qualque…

Materials

AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope
Stereo Microscopes	Leica	M125	Any type of stereo microscopes could do.
150nm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use
1µm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis
Tipless cantiliver	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	TL-NCH-20	to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver
5µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Aradilte	Bartik S.A. 77170 Coubet France		Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver
low melting Agarows	Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410	BP160-100	34-45 Gelation Temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)	M4125-500G
2  Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland	951199