АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

Мы описываем недавно разработанный метод для измерения механических свойств поверхностей растительных тканей с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) микро / нано-углублений, для JPK АСМ. В частности, в этом протоколе мы измеряем модуль кажущейся Юнга клеточных стенок в субклеточных резолюций по регионам до 100 мкм х 100 мкм в цветочных меристем, гипокотиля и корней. Это требует тщательной подготовки образца, правильный выбор микро-инденторами и глубины отступа. Для учета клеточной стенки свойств только, измерения проводятся в высококонцентрированных растворов маннита для того, чтобы плазмолиз клетки и таким образом снять вклад давления клеток тургор.

В отличие от других существующих методов, с помощью различных инденторами и глубины отступа, этот метод позволяет проводить измерения одновременное многомасштабных, <em> Т.е. в субклеточных резолюций и через сотни клеток, содержащих ткани. Это означает, что теперь можно пространственно-временном характеризуют изменения, которые происходят в механических свойств клеточных стенок в процессе разработки, что позволяет эти изменения коррелируют с роста и дифференцировки. Это представляет собой ключевой шаг, чтобы понять, как скоординированные микроскопические клеточные изменения вызывают макроскопических морфогенетических событий.

Тем не менее, остаются некоторые ограничения: метод может быть использован только на довольно небольших образцов (около 100 мкм в диаметре), и только на внешних тканей; метод чувствителен к ткани топографии; он измеряет лишь некоторые аспекты сложных механических свойств ткани в. Техника в настоящее время быстро развивается, и вполне вероятно, что большинство из этих ограничений будут решены в ближайшее время.

Introduction

Рост растений достигается за счет согласованного расширения жестких клеточных стенок, которые окружают каждую ячейку организма. Количество фактов говорит о том, что в результате изменения химии клеточной стенки, что растения локально контролировать это расширение. Расширение, как полагают, в основном за счет деформации на клеточных стенках, вызванные высоким давлением тургор клетки; этот штамм ответ на давление тургора регулируется механических свойств клеточных стенок ^1. Мало что известно о этих механических свойств и как они изменяются в процессе разработки. Кроме того мало известно о том, как эти механические свойства контролируются и способствовать ли обратные изменить химию клеточной стенки таким образом, что, по-видимому скоординированных через ткань. Если мы хотим понять связь между химическим и механическим изменениям в клеточных стенок растений в процессе разработки, и, в конечном счете, как эти микроскопические взаимодействия регулируют завод'Ы макроскопического рост, метод, который может контролировать механические свойства клеточных стенок в развивающихся органы на клеточном или ткани масштабе требуется.

Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), описанный здесь, в основе которого лежит микрометра или нанометровых сжатий ткани или углублений, была разработана именно для измерения механических свойств клеточных стенок в развивающихся органы одновременно в субклеточных резолюций и через целых регионов ткани. Другие методы имеют либо разрешение, что слишком низкая или слишком высокая: экстензометр только в состоянии измерить средние механические свойства целого ткани в миллиметровом масштабе ^2-4, в масштабе, который является, например слишком большой для измерения ранние события в органогенез; microindenter может проводить измерения на субклеточном разрешением в нанометровом масштабе, но она ограничена измерения изолированных клеток и не группы клеток или органов ^5-7. С АСМ, требуютг ткани, клеточном, и субклеточных резолюции может быть достигнуто ^8-10. Недавно несколько протоколов были разработаны специально для измерения механику растений ткани, которые также могут быть использованы ^{11, 12.}

Мы представим здесь, как оценить эластичность ткани через измерения модуля кажущейся Юнга ^13.

Модуль упругости обычно используется для описания жесткость материала. В малой деформации усилие, необходимое для деформации материала пропорциональна площади отступа. Юнга это коэффициент. В случае непрерывного однородного материала такой же коэффициент будет измеряться независимо от типа отпечатка (размер и форма), но будет изменяться со скоростью измерения. В случае сложной структуры ткани растений, мы наблюдали до сих пор, что сила пропорциональна деформации, позволяющей определитькоэффициент пропорциональности, что мы называем "Видимая Юнга". В отличие от непрерывных средств массовой информации на заводах, это очевидно модуль Юнга чувствителен к размеру отступа. Это не соответствует молодого модулей чистого клеточной стенки. Это лучше всего описывает упругость лесов клеточной стенки ткани.

Protocol

1. Подготовьте предметные стекла для монтажа Пример Подготовка вложения агарозном СМИ: 0,7% низкий агарозы плавления в 10% маннита (в воде). Использование сильный металлический инструмент (например, буровой наконечник лайма), гравировать на см площадь 0,5 х 0,5 в центре микрос?…

Representative Results

На рисунке 1 мы приводим типичные значения модуля Юнга карты цветочными меристем (рис. 1a и 1b), молодые и старые гипокотили (рис. 1С-F), и корневой меристемы (рис. 1G и 1Н). Во всех экспериментах индентора полусферической, но его радиус отличается те…

Discussion

В растениях, изменение механических свойств играют важную роль в направляя рост и морфогенез. На сегодняшний день наблюдается большой прогресс в разгадке генетические и химические сетей, которые контролируют рост растений, но наши знания о том, как эти сети способствуют и зависят от и?…

Materials

AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope
Stereo Microscopes	Leica	M125	Any type of stereo microscopes could do.
150nm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use
1µm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis
Tipless cantiliver	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	TL-NCH-20	to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver
5µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Aradilte	Bartik S.A. 77170 Coubet France		Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver
low melting Agarows	Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410	BP160-100	34-45 Gelation Temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)	M4125-500G
2  Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland	951199