AFM-baserte Kartlegging av de elastiske egenskapene Cell Vegger: ved Tissue, Cellular, og subcellulære resolusjoner

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

Vi beskriver en nylig utviklet metode for å måle mekaniske egenskaper til overflatene av plantevev ved å bruke atomic force microscopy (AFM) mikro / nano fordypninger, for en JPK AFM. Nærmere bestemt, i denne protokollen vi måle den tilsynelatende Youngs modulus for celleveggene i det subcellulære oppløsninger tvers regioner av opp til 100 pm x 100 pm i blomster meristems, hypocotyls og røtter. Dette krever grundige forberedelser av prøven, riktig valg av mikro-spisser og innrykk dybder. For å ta hensyn til celleveggegenskaper kun er målinger som utføres i høykonsentrerte oppløsninger av mannitol for å plasmolyze cellene, og dermed fjerne bidraget av celle turgor trykk.

I motsetning til andre bevarte teknikker, ved hjelp av ulike spisser og innrykk dybder, gir denne metoden samtidig Multiskala målinger, <em> Dvs. på subcellulære oppløsninger og på tvers av hundrevis av celler som utgjør en vev. Dette betyr at det nå er mulig å karakterisere romlig-timelig de endringer som finner sted i de mekaniske egenskapene til celleveggene under utvikling, slik at disse forandringer til å være korrelert med vekst og differensiering. Dette representerer et viktig steg for å forstå hvordan koordinerte mikroskopiske celleforandringer føre til makroskopiske morphogenetic hendelser.

Imidlertid flere begrensninger forbli: fremgangsmåten bare kan benyttes på relativt små prøver (cirka 100 mikrometer i diameter), og bare den ytre vev; fremgangsmåten er følsom for vev topografi; den måler bare visse aspekter av vev komplekse mekaniske egenskaper. Teknikken er utviklet seg raskt, og det er sannsynlig at de fleste av disse begrensningene vil bli løst i nær fremtid.

Introduction

Vekst i anlegg oppnås ved den koordinerte ekspansjon av de stive cellevegger som omgir hver celle av organismen. Akkumulerende bevis indikerer at det er gjennom modifisering av celleveggen kjemi som plantene lokalt styre denne ekspansjonen. Utvidelsen er tenkt å bli drevet hovedsakelig av belastningen på celleveggene, som følge av cellens høye turgor trykk; denne stamme respons på turgor trykket er styrt av de mekaniske egenskapene til celleveggene ^1. Lite er kjent om disse mekaniske egenskaper og hvordan de endres under utvikling. Videre lite er kjent om hvordan disse mekaniske egenskaper er kontrollert og om feedbacks bidra til å endre celleveggen kjemi på en måte som er tilsynelatende koordinert på tvers av en vev. Hvis vi skal forstå sammenhengen mellom kjemiske og mekaniske endringer i plantecellevegger under utvikling, og til slutt hvordan disse mikroskopiske interaksjoner styrer en plante'S makroskopisk vekst, en fremgangsmåte som kan følge med mekaniske egenskapene til celleveggene i utviklings organer på celle eller vev skala er nødvendig.

Atomic force mikroskopi (AFM) metoden beskrevet her, som er basert på mikrometer eller nanometer vev kompresjoner eller fordypninger, ble utviklet nettopp for å måle de mekaniske egenskapene til celleveggene i utviklings organer samtidig på subcellulære oppløsninger og på tvers av hele regioner av vev. Andre metoder har enten en oppløsning som er for lav eller for høy: the ekstensometer er bare i stand til å måle de gjennomsnittlige mekaniske egenskaper av en helt vev på millimeterskala ^2-4, en skala som er for eksempel for stor til å måle tidlige hendelser organogenesen; den microindenter kan ta målinger på subcellulære oppløsningen i nanometerskala, men den er begrenset til måling av isolerte celler og ikke-grupper av celler eller organer ^5-7. Med AFM, det kreverd vev, celle, og subcellulære oppløsninger kan oppnås ^8-10. Nylig flere protokoller er blitt utviklet spesielt for å måle mekanikken planter vev som også kan brukes ^{11, 12.}

Vi skal her vise hvordan man skal vurdere elastisiteten av vevet gjennom måling av den tilsynelatende Youngs modulus ^13..

The Young modulus er ofte brukt til å beskrive den stivhet av et materiale. Under liten deformasjon kraften som kreves for å deformere et materiale som er proporsjonal med arealet av fordypningen. The Young modulus er denne koeffisienten. I tilfelle av en kontinuerlig homogent materiale den samme koeffisient vil bli målt uavhengig av innrykket type (størrelse og form), men vil endre seg med hastigheten av målingen. Når det gjelder den komplekse struktur av planter vev, har vi observert så langt at den kraft som er proporsjonal med deformasjonen slik at bestemmelse aven koeffisient av forholdsmessighet at vi nevne "tilsynelatende ung modulus". I kontrast fra kontinuerlige medier i planter, er dette tydelig elastisitet følsom for størrelsen av fordypningen. Det stemmer ikke overens med den unge moduli av en ren cellevegg. Den beskriver beste elastisitet av stillaset i den cellevegg av vevet.

Protocol

En. Forbered Glass Slides for montering Sample Forbered tilføre agarose middel: 0,7% lavtsmeltende agarose i 10% mannitol (i vann). Ved hjelp av en sterk metallinstrument (f.eks drill spissen, lime), etse ut en 0,5 x 0,5 cm område i sentrum av en mikros glass slide. Eller istedenfor, lim en liten del av glass lamellen (ca. 20 x 200 mm) til glass-slide ved hjelp av Araldit-lim. MERK: Dette vil ødelegge overflaten for å lette vedheft av agarose for å sikre at de agarose medie pinner elle…

Representative Results

I figur 1 viser vi typiske Unge moduli kart floral meristems (Tall 1A og 1B), unge og gamle hypocotyls (Tall 1C-F), og rot meristeme (figur 1G og 1H). I alle eksperimenter indenter er halvkuleformet, men dens radius forskjellig slik at ulike romlig oppløsning kan oppnås Tall 1C og 1D viser typiske resultater for meso-nanoskala indenters (50 nm radius) med meso-nanoskala fordypninger (…

Discussion

I planter, endrede mekaniske egenskaper spiller en viktig rolle for å styre vekst og morphogenesis. Til dags dato har det vært stor fremgang i rakne de genetiske og kjemiske nettverk som styrer plantevekst, men vår kunnskap om hvordan disse nettverkene bidra til og påvirkes av endringer i mekaniske egenskaper er rudimentær. Denne metoden skal gjøre oss i stand til å fylle dette gapet, og så det bør være av stor interesse for forskere som studerer noen aspekter av plantevekst eller morphogenesis. Vi har nå opp…

Materials

AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope
Stereo Microscopes	Leica	M125	Any type of stereo microscopes could do.
150nm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use
1µm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis
Tipless cantiliver	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	TL-NCH-20	to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver
5µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Aradilte	Bartik S.A. 77170 Coubet France		Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver
low melting Agarows	Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410	BP160-100	34-45 Gelation Temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)	M4125-500G
2  Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland	951199