AFM-baserad Kartläggning av de elastiska egenskaperna hos cellväggar: i Tissue, Cellulär och Subcellulära resolutioner

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

Vi beskriver en nyligen utvecklad metod för att mäta mekaniska egenskaper hos ytorna av växtvävnader med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM) mikro / nanointryckningar, för en JPK AFM. Närmare bestämt i detta protokoll mäter vi den skenbara elasticitetsmodulen av cellväggarna på subcellulära upplösningar i olika regioner på upp till 100 ^ m x 100 | im i floral meristem, hypokotyler och rötter. Detta kräver noggranna förberedelser av provet, rätt val av mikro indentorer och indrag djup. Att redogöra för cellväggs egenskaper endast är mätningar som utförs i starkt koncentrerade lösningar av mannitol för att plasmolyze cellerna och på så sätt ta bort bidraget av cellsaftspänningen.

I motsats till andra ännu existerande tekniker, genom att använda olika indentorer och indrag djup medger denna metod samtidig multiskalmätningar, <em> Dvs på subcellulära upplösningar och över hundra celler som innefattar en vävnad. Detta innebär att det nu är möjligt att rumsligt-tidsmässigt karakterisera de förändringar som sker i de mekaniska egenskaperna hos cellväggarna under utveckling, vilket gör att dessa förändringar ska korrelerade med tillväxt och differentiering. Detta är ett viktigt steg för att förstå hur samordnade mikroskopiska cellförändringar åstadkomma makroskopiska formbildnings händelser.

Men flera begränsningar kvarstår: den metoden kan bara användas på relativt små prov (cirka 100 nm i diameter) och endast på externa vävnader; metoden är känslig för vävnads topografi; den mäter endast vissa aspekter av vävnad komplexa mekaniska egenskaper. Tekniken utvecklas snabbt och det är troligt att de flesta av dessa begränsningar kommer att lösas inom en snar framtid.

Introduction

Tillväxt i växter uppnås genom den samordnade expansion av de styva cellväggar som omger varje cell av organismen. Ackumulerande bevis tyder på att det är genom ändring av cellväggen kemi som växter styr expansionen lokalt. Utbyggnaden är tänkt att drivas främst av belastning på cellväggarna, som orsakas av cellens höga saftspänningen; denna stam svar på saftspänningen styrs av de mekaniska egenskaperna hos cellväggarna ^1. Lite är känt om dessa mekaniska egenskaper och hur de förändras under utveckling. Dessutom lite är känt om hur dessa mekaniska egenskaper styrs och om återkopplingar bidrar till att förändra cellväggen kemi på ett sätt som uppenbarligen samordnas över en vävnad. Om vi ​​ska förstå sambandet mellan kemiska och mekaniska förändringar i växtcellväggar under utveckling, och i slutändan hur dessa mikroskopiska interaktioner styr en anläggningKrävs makroskopisk tillväxt är en metod som kan övervaka mekaniska egenskaper hos cellväggarna i utvecklings organ vid cell-eller vävnadsskala.

Den atomkraftsmikroskopi (AFM) metod som beskrivs här, vilket är baserat på mikrometer eller nanometervävnadskompressioner eller fördjupningar, har utvecklats just för att mäta de mekaniska egenskaperna hos cellväggarna i utvecklingsorganen samtidigt vid subcellulära upplösningar och över hela regioner i vävnad. Andra metoder har antingen en upplösning som är för låg eller för hög: extenso endast kan mäta de genomsnittliga mekaniska egenskaperna hos en hel vävnad vid millimeterskala ^2-4, en skala som är till exempel för stora för att mäta tidiga händelser i organogenesen; den microindenter kan göra mätningar på subcellulär upplösning på nanometerskala, men den är begränsad till att mäta isolerade celler och inte grupper av celler eller organ ^5-7. Med AFM, den kräverd vävnad, cellulär och subcellulära resolutioner kan uppnås ^8-10. Nyligen flera protokoll har utvecklats specifikt för att mäta mekanik växter vävnad som också skulle kunna användas ^{11, 12.}

Vi kommer att presentera här hur man utvärderar elasticiteten hos vävnaden genom mätning av den skenbara elasticitetsmodulen ^13.

The Young modul används ofta för att beskriva styvheten hos ett material. Under liten deformation den kraft som krävs för att deformera ett material är proportionell mot arean av indrag. The Young modul är denna koefficient. I fallet med ett kontinuerligt homogent material samma koefficient kommer att mätas oavsett typen fördjupning (storlek och form), men kommer att förändras med hastigheten på mätningen. I fallet med den komplexa strukturen av växter vävnad, har vi observerat så långt att den kraft som är proportionell mot den deformation som gör det möjligt att fastställaen koefficient på proportionalitet som vi namn "skenbar elasticitet". Till skillnad från kontinuerliga medier i växterna, är det uppenbart elasticitet känslig för storleken på indraget. Det motsvarar inte den unga moduler av en ren cellvägg. Den beskriver bäst elasticiteten i byggnadsställningar för cellväggen av vävnaden.

Protocol

1. Förbered glas för Monterings Sample Förbered imbedding agaros medel: 0,7% lågsmältande agaros i 10% mannitol (i vatten). Med hjälp av en stark metallinstrument (t.ex. borrspets, lime), etsa ut en 0,5 x 0,5 cm stort område i centrum av en mikroskopglas. Eller i stället, limma en liten bit av glas lamell (ca 20 x 200 | im) till objektglaset med hjälp av Araldite lim. OBS: Detta luckrar ytan för att underlätta vidhäftningen av agaros för att säkerställa att agarosen medie pin…

Representative Results

I figur 1 presenterar vi typiska Unga modul kartor över blomster meristems (figur 1a och 1b), unga och gamla hypokotyler (figur 1C-F), och rot meristem (figur 1G och 1H). I alla experiment indenter är halvsfärisk, men dess radie skiljer sig så som kan uppnås olika rumsliga upplösningar Figurer 1C och 1D visar typiska resultat för meso-nano indentorer (50 nm radie) med meso-nanosk…

Discussion

I växter, förändrade mekaniska egenskaper spelar en stor roll i att styra tillväxt och morfogenes. Hittills har det skett stora framsteg i att riva upp de genetiska och kemiska nätverk som styr växternas tillväxt, men kunskapen om hur dessa nätverk bidrar till och påverkas av förändringar i de mekaniska egenskaperna är rudimentär. Denna metod bör göra det möjligt för oss att fylla denna lucka, och så det borde vara av stort intresse för forskare som studerar alla aspekter av växters tillväxt eller m…

Materials

AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope
Stereo Microscopes	Leica	M125	Any type of stereo microscopes could do.
150nm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use
1µm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis
Tipless cantiliver	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	TL-NCH-20	to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver
5µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Aradilte	Bartik S.A. 77170 Coubet France		Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver
low melting Agarows	Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410	BP160-100	34-45 Gelation Temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)	M4125-500G
2  Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland	951199