AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Methode, um die mechanischen Eigenschaften der Oberflächen von Pflanzengeweben für ein JPK AFM-Messung mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) Mikro / Nano-Vertiefungen. Insbesondere wird in diesem Protokoll wir das scheinbare Elastizitätsmodul der Zellwände zu messen subzellulären Auflösungen in den Regionen von bis zu 100 &mgr; m × 100 &mgr; m in Blütenmeristemen, Hypokotylen und Wurzeln. Dies erfordert eine sorgfältige Vorbereitung der Probe, die richtige Auswahl der Mikro-Eindringkörper und Eindringtiefen. Um die Zellwand nur Eigenschaften werden Messungen in hochkonzentrierten Lösungen von Mannitol, um die Zellen plasmolysieren beseitigen und damit den Beitrag der Zelle Turgor geführt ausmachen.
Im Gegensatz zu anderen vorhandenen Techniken, durch die Verwendung unterschiedlicher Eindringkörpern und Eindringtiefen ermöglicht dieses Verfahren die gleichzeitige Multiskalen-Messungen <em> Dh bei subzellulärer Auflösungen und über Hunderte von Zellen, die ein Gewebe. Dies bedeutet, dass es nun möglich ist, räumlich-zeitlich charakterisieren die Veränderungen in den mechanischen Eigenschaften der Zellwände während der Entwicklung zu nehmen, so dass diese Änderungen mit Wachstums-und Differenzierungs korreliert werden. Damit ist ein wichtiger Schritt, um zu verstehen, wie koordinierte mikroskopischen Zellveränderungen bewirken makroskopischen morphogenetischen Ereignisse.
Es bleiben jedoch mehrere Einschränkungen: Das Verfahren kann nur für relativ kleine Proben (etwa 100 um Durchmesser) und nur an äußeren Gewebe verwendet werden; die Methode ist empfindlich, um Gewebe Topographie; sie misst nur bestimmte Aspekte des Gewebes komplexen mechanischen Eigenschaften. Die Technik wird schnell entwickelt, und es ist wahrscheinlich, dass die meisten dieser Beschränkungen werden in naher Zukunft gelöst werden.
Introduction
Wachstum der Pflanzen wird durch die koordinierte Ausdehnung der starren Zellwänden, die jede einzelne Zelle des Organismus umgibt erreicht. Zunehmend Hinweise darauf, zeigt, dass es durch die Modifikation der Zellwand der Chemie, dass Pflanzen lokal diese Expansion zu steuern. Die Expansion wird angenommen, dass in erster Linie durch Druck auf den Zellwänden von hohen Turgor der Zelle verursacht angetrieben zu werden; Dieser Stamm Reaktion auf Turgor wird durch die mechanischen Eigenschaften der Zellwände 1 geregelt. Wenig ist von dieser mechanischen Eigenschaften bekannt und wie sie während der Entwicklung ändern. Weiterhin ist wenig wie diese mechanischen Eigenschaften gesteuert werden, und ob erteilen tragen zur Zellwandchemie in einer Weise, die offensichtlich in einer Gewebe koordiniert verändern bekannt. Wenn wir die Verbindung zwischen chemischen und mechanischen Veränderungen in der Pflanzenzellwände während der Entwicklung, und schließlich, wie diese mikroskopischen Wechselwirkungen regieren ein Werk verstehen'S makroskopischen Wachstums, eine Methode, die die mechanischen Eigenschaften der Zellwände bei der Entwicklung von Organen an der Zell-oder Gewebe Maßstab überwachen erforderlich.
Die Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Methode hier beschrieben, die auf Mikrometer-oder Nanometergewebekompressionen oder Vertiefungen basiert, wurde entwickelt, um genau die mechanischen Eigenschaften der Zellwände in der Entwicklung gleichzeitig Organe auf subzellulärer Auflösungen und über ganze Regionen des Gewebes zu messen. Andere Methoden entweder eine Auflösung, die zu niedrig oder zu hoch ist: das Extensometer ist nur in der Lage, die durchschnittlichen mechanischen Eigenschaften eines ganzen Gewebes an der Millimeter-Skala 2-4, einer Skala, die beispielsweise zu groß, um in frühen Ereignisse zu messen, ist zu messen Organogenese; die Mikroindenter können Messungen an subzellulärer Auflösung im Nanometerbereich, aber es wird in den Messzellen isoliert und nicht Gruppen von Zellen oder Organen 5-7 beschränkt. Mit der AFM, die erforderlichd Gewebe, Zell und subzellulärer Auflösungen 8-10 erreicht werden. Kürzlich mehrere Protokolle wurden speziell entwickelt, um Mechanismen der Gewebe Pflanzen, die auch verwendet werden könnte, 11, 12 zu messen.
Wir werden hier präsentiert, wie die Elastizität des Gewebes durch Messung der scheinbaren Elastizitätsmodul 13 zu beurteilen.
Der Elastizitätsmodul wird häufig verwendet, um die Steifigkeit eines Materials zu beschreiben. Während kleine Verformung der erforderlich ist, um ein Material zu verformen Kraft ist proportional zur Fläche des Eindrucks. Der E-Modul ist dieser Koeffizient. Im Fall einer kontinuierlichen homogenen Material die gleichen Koeffizienten unabhängig von der Einrückung Typ (Größe und Form) gemessen werden, jedoch wird mit der Geschwindigkeit der Messung verändern. Im Falle der komplexen Struktur von Pflanzen Gewebe haben wir so weit, dass die Kraft proportional zu der Deformation, die die Bestimmung der beobachtetenein Koeffizient der Verhältnismäßigkeit, die wir nennen "scheinbare Elastizitätsmodul". Im Gegensatz von kontinuierlichen Medien in den Pflanzen ist diese scheinbare Elastizitätsmodul empfindlich auf die Größe der Vertiefung. Es muss nicht auf die jungen Moduli eines reinen Zellwand entsprechen. Es beschreibt die beste Elastizität des Gerüsts der Zellwand des Gewebes.
Protocol
Representative Results
Discussion
In Pflanzen spielen wechselnden mechanischen Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Leitung Wachstum und Morphogenese. Bis heute hat es große Fortschritte in der Entschlüsselung der genetischen und chemischen Netzwerke, die das Pflanzenwachstum zu kontrollieren, aber unser Wissen, wie diese Netzwerke beitragen, und sind durch Veränderungen der mechanischen Eigenschaften betroffen ist rudimentär. Diese Methode sollte es uns ermöglichen, diese Lücke zu füllen, und so sollte es ein starkes Interesse an Wissenscha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir geben besonderen Dank an Yves Couder für viele hilfreiche Diskussionen. Wir danken Atef Asnacios zur Kalibrierung der Ausleger und Diskussion. Wir danken Lisa Willis, Elliot Meyerowitz und Oliver Hamant für das kritische Lesen. Diese Arbeit wurde zum Teil von Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C Zuschuss finanziert werden; der Agence Nationale de la Recherche-Projekte Growpec'','' und'''' Mechastem.
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
References
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
