ספקטרוסקופיה התפלגות מושרה לייזר: גישה חדשה למיפוי של Nanoparticle וכימות ברקמות איברים
Summary
ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר מבוצעת על איבר דק ורקמת גידול זוהתה בהצלחה אלמנטים טבעיים וגדוליניום המוזרק באופן מלאכותי (ה '), שהונפקו מחלקיקים המבוססים על ה'. תמונות של יסודות כימיים הגיעו לרזולוציה של 100 מיקרומטר ורגישות תת מ"מ כמותית. התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק מספר רב של תמונות מאותה רקמה ביולוגית.
Abstract
ספקטרוסקופית פליטה של פלזמה מושרה לייזר הייתה מוחלת על ניתוח יסודי של דגימות ביולוגיות. ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר (LIBS) שבוצע בסעיפים דקים של רקמות מכרסמים: כליות וגידול, מאפשר זיהוי של אלמנטים אורגניים כגון (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, ופה, באופן טבעי בגוף ו (Ii) Si וה ', שאותרו לאחר ההזרקה של חלקיקים המבוסס על גדוליניום. החיות מורדמים 1-24 שעות לאחר הזרקה תוך ורידית של חלקיקים. סריקה דו ממדית של המדגם, שבוצעה באמצעות 3D בשלב micrometric ממונע, אפשר לקרן לייזר אינפרא אדום לחקור את פני השטח ברזולוציה רוחב של פחות מ -100 μ מ '. תמונות כימיות הכמותי של אלמנט הקב"ה בתוך האיבר התקבלו עם רגישות תת מ"מ. LIBS מציע שיטה פשוטה וחזקה כדי ללמוד את ההפצה של חומרים אורגניים ללא כל labeli ספציפיng. יתר על כן, את התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק תמונות מרובות של אותו הרקמה ביולוגית עם סוגים שונים של תגובה: יסודות, מולקולריים, או סלולריים.
Introduction
הפיתוח הרחב של חלקיקים עבור יישומים ביולוגיים דחק בשיפור המקביל של שיטות אנליטיות לכימותם והדמיה בדגימות ביולוגיות. בדרך כלל זיהוי והמיפוי של חלקיקים באיברים מבוצעים על ידי הקרינה או confocal. למרבה הצער שיטות אלה דורשים התיוג של חלקיקים על ידי צבע אינפרא אדום קרוב שיכול לשנות את biodistribution של חלקיקים, במיוחד לחלקיקים קטנים מאוד בשל המאפיינים הידרופובי שלה. הגילוי של חלקיקים שכותרתו, ובעיקר חלקיקים קטנים מאוד (גודל <10 ננומטר), ובכך עלול להפריע לbiodistribution שלהם בכל קנה המידה הגוף, אלא גם ברמת הרקמות ותאים. הפיתוח של מכשירים חדשים מסוגלים לזהות חלקיקים ללא כל תיוג מציע אפשרויות חדשות לחקר ההתנהגות וקינטיקה שלהם. יתר על כן, תפקידיו של יסודות קורט כגון ברזל ונחושת במוח מחלותמחלות ניווניות כגון ד 1 אלצהיימר, מנקס 2,3, או 4 וילסון מציעות ריבית ללמוד ולמקם רכיבים אלה ברקמות.
טכניקות שונות שימשו כדי לספק מיפוי או microanalysis יסודות של חומרים שונים. במאמר הביקורת שפורסם ב2006, ר 'Lobinski et al. סיפק סקירה של טכניקות סטנדרטיות זמינות עבור microanalysis יסודות בסביבה ביולוגית, אחת מהסביבות המאתגרות ביותר עבור מדעים אנליטיים 5. Microprobe האלקטרון, אשר מורכב מmicroanalysis רנטגן נפיצה אנרגיה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, יכול להיות מיושם על מחקרים רבים אם ריכוז המרכיב מספיק (> 100-1,000 מיקרוגרם / g). כדי להגיע למגבלות זיהוי נמוכות יותר, בטכניקות הבאות היו בשימוש:
- μ-PIXE (1-10 מיקרוגרם / g) microprobe אלומת יונים באמצעות חלקיקים המושרה רנטגן פליטה 6
- synchrotron microanalysis קרינת μ-SXRF (0.1-1 מיקרוגרם / גרם) 7
- ספקטרומטריית מסת יונים משני Sims (0.1 מיקרוגרם / גרם) 8
- אבלציה לייזר אינדוקטיבי מצמידים ספקטרומטריית מסת LA-ICP-MS (עד 0.01 מיקרוגרם / g) 9,10
הטכניקות הנ"ל מספקות רזולוציה micrometric כפי שמוצגות בטבלת 1 שחולץ מן Lobinski et al.
שחזור 3D של חקירות 2D סידוריים יכול להיות גם הציע לבנייה מחדש של רקמות עמוקות יותר 11. עם זאת, כל המכשירים והמערכות דורשים שני אנשי מקצוע מוסמכים, בדרגה בינוני עד ציוד יקר מאוד וניסויים לטווח ארוכים (בדרך כלל יותר מ 4 שעות ל100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר לμ-SXRF ו10 מ"מ x 10 מ"מ לLA-ICP-MS ) 12. בסך הכל, דרישות אלה הופכים microanalysis יסודות מאוד מגבילים ועולה בקנה אחד עם מערכות הדמיה אופטית קונבנציונליות,מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופיה לא לינארית. נקודה נוספת שאנו יכולים להזכיר כאן היא שיכולת מדידת כמותית היא עדיין די מוגבלת ותלויה בזמינות של סטנדרטים מעבדה בהתאמה מטריצה. הכללה נוספת של השימוש בmicroanalysis יסודות בתהליכים בתעשייה, גיאולוגיה, ביולוגיה ותחומים אחרים של יישומים תפיק פריצות דרך רעיוניות וטכנולוגית משמעותיות.
מטרתו של כתב היד הנוכחית היא להציע פתרונות למיפוי הכמותי יסודות (או microanalysis יסודות) ברקמות ביולוגיות עם מכשור שולחן תואם באופן מלא עם מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית. הגישה שלנו מבוססת על ספקטרוסקופיית לייזר המושרה ההתמוטטות (טכנולוגית LIBS). בLIBS, דופק לייזר הוא על המדגם של עניין ממוקד כדי ליצור את ההתמוטטות וניצוץ של החומר. הקרינה האטומית הנפלטת בפלזמה מנותחת לאחר מכן על ידי ספקטרומטר וelemenניתן לאחזר ריכוזי טל עם מדידות כיול מבוצעות מראש 13,14. היתרונות של LIBS כוללים רגישות (מיקרוגרם / גרם כמעט לכל אלמנטים), קומפקטיות, הכנת מדגם בסיסית מאוד, היעדר מגע עם המדגם, תגובה מיידית ומקומי דווקא ניתוח (מיקרו) לפני השטח. עם זאת, היישום של הדמיה כימית רקמה נותר מאתגר מאז אבלציה הלייזר של רקמה חייבת להיות מבוקר היטב לבצע מפות עם רזולוציה מרחבית גבוהה יחד עם רגישות בטווח מיקרוגרם / g 15,16.
עם פתרון כזה, ספוח של קליעים נותבים או סוכני תיוג אינו נחוץ, המאפשר איתור מרכיבים אורגניים ישירות בסביבה המקומית שלהם ברקמות ביולוגיות. מכשיר LIBS שפותח במעבדה שלנו מציע רזולוציה נוכחית נחות 100 מיקרומטר עם רגישות המשוערת לקב"ה מתחת 35 מיקרוגרם / g, שווה ערך ל 0.1 מ"מ 16, המאפשרהמיפוי של דגימות גדולות (> 1 סנטימטר 2) בתוך 30 דקות. בנוסף, תוכנת תוצרת בית מאפשרת הרכישה וניצול של הנתונים. מכשיר זה משמש לאיתור, המיפוי ולכמת את רקמות ההפצה של גדוליניום מבוסס חלקיקים (ה ') 17-18 בכליות ודגימות גידול מבעלי חיים קטנים, 1-24 שעות לאחר הזרקה תוך ורידית של החלקיקים (גודל <5 ננומטר) . אלמנטים אורגניים, שמכילים באופן מהותי ברקמה ביולוגית, כמו Fe, Ca, Na, ו-P, יש גם זוהו וצלמו.
Protocol
Representative Results
Discussion
יחול על דגימה ביולוגית, טכניקה זו מאפשרת הדמיה הכימית, כלומר המיפוי והכימות, ה 'וסי מחלקיקים המבוססים על ה' שהוחדרו באיברים שונים. מההגדרות קריטיות העיקריות, השליטה בתכונות לייזר (אורך גל, אנרגיה דופק, התמקדות, ויציבות) היא קריטית לאבלציה מדויקת ועדינה רקמה <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים בתודה להכיר תמיכה כספית על ידי Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
