Induzida por laser Breakdown Spectroscopy: Uma Nova Abordagem para Mapeamento e Quantificação de nanopartículas em Organ Tissue
Summary
Espectroscopia de decomposição induzida por laser realizada em órgão fina e tecido do tumor detectado com sucesso elementos naturais e gadolínio injetado artificialmente (Gd), emitidos a partir de nanopartículas à base de Gd. Imagens de elementos químicos atingiu uma resolução de 100 um e sensibilidade quantitativa sub-mM. A compatibilidade da instalação com microscopia óptica padrão enfatiza seu potencial para fornecer várias imagens de um mesmo tecido biológico.
Abstract
A espectroscopia de emissão de plasma induzido por laser foi aplicado para a análise elementar de amostras biológicas. Espectroscopia de desagregação induzida por laser (LIBS) realizada em secções finas de tecido de roedor: rins e do tumor, permite a detecção de elementos inorgânicos, tais como (i) de Na, Ca, Cu, Mg, P, e Fe, presente naturalmente no corpo e (ii) Si e D'us, detectada após a injeção de nanopartículas à base de gadolínio. Os animais foram sacrificados 1 a 24 horas após a injecção intravenosa de partículas. Um varrimento bidimensional da amostra, realizada por meio de um micrométrica 3D-platina motorizada, permitiu que o feixe de laser de infravermelho a explorar a superfície com uma resolução lateral inferior a 100 μ m. Imagens química quantitativa de elemento Gd dentro do órgão foram obtidos com sensibilidade sub-mM. LIBS oferece um método simples e robusto para estudar a distribuição de materiais inorgânicos sem qualquer labeli específicong. Além disso, a compatibilidade da instalação com microscopia óptica padrão enfatiza seu potencial para fornecer várias imagens do mesmo tecido biológico com diferentes tipos de resposta: elementares, moleculares ou celulares.
Introduction
O grande desenvolvimento de nanopartículas para aplicações biológicas incitou a melhoria paralela de técnicas analíticas para a sua quantificação e formação de imagens de amostras biológicas. Normalmente, a detecção e o mapeamento das nanopartículas em órgãos são feitos por fluorescência ou microscopia confocal. Infelizmente, estes métodos requerem a rotulagem das nanopartículas por um corante do infravermelho próximo que pode alterar a biodistribuição das nanopartículas, em especial para as nanopartículas de muito pequenas, devido às suas propriedades hidrofóbicas. A detecção de nanopartículas rotulados, e especialmente as muito pequenas nanopartículas (tamanho <10 nm), pode, assim, interferir com a sua biodistribuição em toda a escala do corpo, mas também a nível de tecidos e células. O desenvolvimento de novos dispositivos capazes de detectar nanopartículas sem qualquer rotulagem oferece novas possibilidades para o estudo do seu comportamento e cinética. Além disso, o papel de elementos vestigiais tais como ferro e cobre em doenças cérebro umd doenças neurodegenerativas, como Alzheimer 1, Menkes 2,3, ou Wilson 4 sugerem o interesse de estudar e localizar esses elementos em tecidos.
Várias técnicas têm sido utilizadas para fornecer mapeamento elementar ou microanálise de materiais diferentes. Em seu artigo de revisão publicado em 2006, R. lobinski et al. Forneceu uma visão geral das técnicas padrão disponíveis para microanálise elementar em meio biológico, um dos ambientes mais desafiadores para as ciências analíticas 5. A microssonda de electrões, que é constituído por energia dispersiva de microanálise de raios X de um microscópio electrónico de transmissão, pode ser aplicado a numerosos estudos se a concentração do elemento é suficiente (> 100-1.000 mg / g). Para alcançar limites de detecção mais baixos, foram utilizadas as seguintes técnicas:
- microssonda feixe de íons através das partículas induzida emissão de raios X μ-PIXE (1-10 mg / g) 6
- synchrotron microanálise radiação μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- espectrometria de massa de iões secundários SIMS (0,1 ug / g) 8
- ablação a laser em espectrometria de massas LA-ICP-MS (até 0,01 mg / g) 9,10
As técnicas acima mencionadas proporcionam resolução micrométrica, como mostrado na Tabela 1 extraiu-se a partir de lobinski et al.
Reconstrução 3D de investigações 2D de série também pode ser proposto para a reconstrução de tecidos mais profundos 11. No entanto, todos os dispositivos e sistemas exigem profissionais qualificados, ambos moderados para equipamentos de alto custo e experimentos de longa duração (normalmente mais de 4 h para um mM 100 x 100 mm para μ-SXRF de 10 mm x 10 mm para LA-ICP-MS ) 12. Em conjunto, esses requisitos tornam microanálise elementar muito restritivo e incompatível com sistemas de imagem óptica convencional,A microscopia de fluorescência ou microscopia não linear. Um outro ponto que se pode mencionar aqui é que a capacidade de medição quantitativa ainda é bastante limitada e depende da disponibilidade dos padrões laboratoriais de correspondência de matriz. Quanto mais generalização do uso de microanálise elementar em processos da indústria, geologia, biologia e outros domínios de aplicações irá gerar avanços conceituais e tecnológicos significativos.
O objectivo da presente manuscrito é propor soluções para mapeamento elementar quantitativa (ou microanálise elementar) em tecidos biológicos com uma instrumentação mesa compatível com microscopia óptica convencional. A nossa abordagem é baseada na espectroscopia de decomposição induzida por laser (tecnologia LIBS). Em LIBS, um pulso de laser é focado na amostra de interesse para criar a composição e centelha do material. A radiação emitida atómica no plasma é subsequentemente analisados por um espectrómetro e os elemenTal concentração pode ser recuperada com medidas de calibração realizados previamente 13,14. As vantagens de LIBS incluem sensibilidade (mg / g para quase todos os elementos), compacidade, preparação muito básico amostra, ausência de contato com a amostra, a resposta instantânea e precisamente localizada (micro) análise de superfície. No entanto, a aplicação da imagem química de tecido permanece um desafio uma vez que a ablação a laser dos tecidos devem ser finamente controlado para realizar mapas com uma elevada resolução espacial, juntamente com o intervalo de sensibilidade em ug / g 15,16.
Com esta solução, a adjunção de marcadores ou agentes de rotulagem não é necessário, o que permite a detecção de elementos inorgânicos directamente no seu ambiente nativo em tecidos biológicos. O instrumento LIBS desenvolvido em nosso laboratório oferece uma resolução atual inferior a 100 mm, com uma sensibilidade estimada para Gd abaixo de 35 mg / g, o equivalente a 0,1 mM 16, que permite queo mapeamento de grandes amostras (> 1 cm 2) dentro de 30 min. Além disso, o software caseiro facilita a aquisição e exploração dos dados. Este instrumento é usado para detectar, mapear e quantificar a distribuição de tecido de gadolínio de nanopartículas à base de (Gd), 17 – 18, em rins e amostras de tumor de animais de pequeno porte, de 1 a 24 horas após a injecção intravenosa das partículas (tamanho <5 nm) . Elementos inorgânicos, que são intrinsecamente contidos em um tecido biológico, tais como Fe, Ca, Na e P, foram também detectadas e gravadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicado a amostra biológica, a técnica permite a imagem química, isto é, o mapeamento e quantificação, de Gd e Si a partir de nanopartículas à base de Gd injectados em diferentes órgãos. A partir das configurações principais críticos, o controlo das propriedades de laser (comprimento de onda, a energia do pulso, centradas, e de estabilidade) é crítico para uma ablação de tecido preciso e fino (ou seja, uma resolução de mapeamento), bem como para a sensibilidade. Trabalhando em alta …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio financeiro do Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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