Laser-inducerad Breakdown Spectroscopy: En ny metod för nanopartiklar s Kartläggning och kvantifiering i organvävnad
Summary
Laser-inducerad nedbrytning spektroskopi utförs på tunn organ och tumörvävnad framgångsrikt upptäckt naturliga element och artificiellt injiceras gadolinium (Gd), utgivna från Gd-baserade nanopartiklar. Bilder av grundämnen nått en upplösning på 100 nm och kvantitativ sub-mM känslighet. Kompatibiliteten av installationen med vanlig optisk mikroskopi betonar dess potential att ge flera bilder av en samma biologisk vävnad.
Abstract
Emissionsspektroskopi av laser-inducerad plasma anbringades på elementaranalys av biologiska prover. Laser-inducerad nedbrytning spektroskopi (LIBS) utföras på tunna sektioner av gnagar vävnader: njurar och tumör tillåter detektion av oorganiska element såsom (i) Na, Ca, Cu, Mg, P och Fe, förekommer naturligt i kroppen och (ii) Si och Gd, detekteras efter injektionen av gadolinium baserade nanopartiklar. Djuren avlivades 1 till 24 h efter intravenös injektion av partiklar. En två-dimensionell avsökning av provet utfördes med användning av en motoriserad mikrometer 3D-scenen, tillät infraröd laserstråle utforskar ytan med en lateral upplösning mindre än 100 μ m. Kvantitativa kemiska bilder av Gd elementet inne i orgeln erhölls med sub-mM känslighet. LIBS erbjuder en enkel och robust metod för att studera fördelningen av oorganiska material, utan någon särskild labeling. Dessutom betonar kompatibilitet setup med vanlig optisk mikroskopi dess potential att ge flera bilder av samma biologiska vävnaden med olika typer av svar: elementärt, molekylära eller cellulära.
Introduction
Den breda utvecklingen av nanopartiklar för biologiska tillämpningar uppmanade parallell förbättring av analysmetoder för kvantifiering och bildbehandling i biologiska prover. Vanligtvis detektering och kartläggning av nanopartiklar i organen är tillverkade genom fluorescens eller konfokalmikroskopi. Tyvärr är dessa metoder kräver märkning av nanopartiklar av en nära infraröda färgämne som kan ändra biodistribution av nanopartiklar, särskilt för mycket små nanopartiklar på grund av dess hydrofoba egenskaper. Upptäckten av märkta nanopartiklar, och särskilt de mycket små nanopartiklar (storlek <10 nm), kan därmed störa deras biodistribution i hela kroppen skalan men även på vävnads-och cellnivå. Utvecklingen av nya apparater som kan upptäcka nanopartiklar utan märkning ger nya möjligheter för att studera deras beteende och kinetik. Dessutom, den roll som spårämnen som järn och koppar i hjärnan sjukdomar end neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers 1, Menkes 2,3 eller Wilson 4 tyder på att intresset för att studera och lokalisera dessa element i vävnader.
Olika tekniker har använts för att ge elementärt kartläggning eller mikroanalys av olika material. I sin översyn artikel publicerad i 2006, R. Lobinski et al. Gav en översikt av tillgängliga standardtekniker för elementär mikroanalys i biologisk miljö, en av de mest utmanande miljöer för analytiska vetenskaper 5. Elektron-mikrosond, som består av energidispersiv röntgenmikroanalys i ett transmissionselektronmikroskop, kan tillämpas på ett stort antal studier om elementet koncentration är tillräcklig (> 100-1000 ng / g). För att nå lägre detektionsgränser, har följande metoder använts:
- jonstråle mikrosond med hjälp av partikel inducerad röntgenstrålning μ-PIXE (1-10 ng / g) 6
- synchrotron strålning mikroanalys μ-SXRF (0,1-1 | ig / g) 7
- sekundär jon masspektrometri SIMS (0,1 mikrogram / g) 8
- laser ablation induktivt kopplad masspektrometri LA-ICP-MS (ner till 0,01 mikrogram / g) 9,10
De ovan nämnda tekniker ger mikrometer upplösning som visas i Tabell 1 som extraherats från Lobinski et al.
3D-rekonstruktion av seriella 2D undersökningar skulle också kunna föreslås för återuppbyggnaden av djupare vävnader 11. Men alla enheter och system kräver både kvalificerade yrkesmänniskor, måttlig till mycket dyr utrustning och långvariga experiment (vanligtvis mer än 4 tim för en 100 ìm x 100 ìm för μ-SXRF och 10 mm x 10 mm för LA-ICP-MS ) 12. Sammantaget dessa krav gör elementär mikroanalys mycket begränsande och oförenlig med konventionell optisk bildsystem,fluorescensmikroskopi eller olinjär mikroskopi. En annan punkt som vi kan nämna här är att den kvantitativa mätförmågan är fortfarande ganska begränsad och beror på tillgängligheten av matrisanpassade laboratoriestandarder. Den ytterligare utbredd användning av elementärt mikroanalys i industriprocesser, geologi, biologi och andra områden av ansökningar kommer att generera betydande konceptuella och tekniska genombrott.
Syftet med föreliggande manuskriptet är att föreslå lösningar för kvantitativ elementärt kartläggning (eller elementär mikroanalys) i biologisk vävnad med en bordsskiva instrumentering fullt kompatibel med konventionell optisk mikroskopi. Vår strategi bygger på laser-inducerad nedbrytning spektroskopi (LIBS-teknik). I LIBS är en laserpuls fokuserad på provet av intresse för att skapa nedbrytningen och gnista av materialet. Atom strålning som emitteras i plasman analyseras därefter av en spektrometer och det elemenTal koncentrationer kan hämtas med kalibreringsmätningar utförda i förväg 13,14. Fördelarna med LIBS innefattar känslighet (ng / g för nästan alla element), kompakthet, mycket grundläggande provberedning, avsaknad av kontakt med provet, omedelbar respons och exakt lokaliserat (mikro) ytanalys. Förblir emellertid tillämpningen av vävnad kemisk avbildning utmanande eftersom laser ablation av vävnad måste vara fint kontrollerad utföra kartor med hög rumslig upplösning tillsammans med känslighet i ug / g intervallet 15,16.
Med en sådan lösning, behövs inte adjunction av spårämnen eller märkningsmedel, vilket möjliggör detektion av oorganiska element direkt i deras naturliga miljö i biologiska vävnader. Den LIBS instrument som utvecklats i vårt laboratorium erbjuder en aktuell upplösning lägre än 100 nm med en beräknad känslighet för Gd under 35 mikrogram / g, vilket motsvarar 0,1 mM 16, vilket gör det möjligtmappningen av stora prover (> 1 cm 2) inom 30 min. Dessutom underlättar hemlagad programvara förvärv och utnyttjande av data. Detta instrument används för att upptäcka, karta, och kvantifiera vävnadsdistributionen av gadolinium (Gd)-baserade nanopartiklar 17-18 i njurar och tumörprover från små djur, 1-24 tim efter intravenös injektion av partiklarna (storlek <5 nm) . Oorganiska element, som i sig ingår i en biologisk vävnad, såsom Fe, Ca, Na, och P, har också upptäckts och avbildas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillämpat på biologiskt prov, ger denna teknik för kemisk avbildning, dvs kartläggning och kvantifiering, Gd och Si från injicerade Gd-baserade nanopartiklar i olika organ. Från de viktigaste kritiska inställningar, är kontrollen av laser egenskaper (våglängd, puls energi, fokus och stabilitet) avgörande för en exakt och fin vävnad ablation (dvs. kartläggning upplösning) samt för känsligheten. Att arbeta på hög energi ger en bättre känslighet men tyvärr ger försämrad rumslig upp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd från Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
