Super-opløsning Imaging af neuronale Dense-core blærer
Summary
Vi beskriver, hvordan man gennemfører fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM)-baserede studier af vesikler i faste, dyrkede neuroner. De centrale elementer i vores protokol omfatter mærkning blærer med photoconvertible kimærer, indsamling af spredte, indsamlede rå billeder med en super-opløsning mikroskopi system og behandling af RAW-billeder til at producere en super-opløsning.
Abstract
Påvisning af fluorescens danner grundlaget for mange almindeligt anvendte og fremskridtsprægede mikroskopi teknikker, der anvendes i moderne biologiske og medicinske anvendelser. Styrker af fluorescens omfatter dens sensitivitet, specificitet og kompatibilitet med levende billeddannelse. Desværre konventionelle former for fluorescensmikroskopi lider en stor svaghed, diffraktionsbegrænset opløsning i afbildningsplanet, hvilket vanskeliggør undersøgelser af strukturer med dimensioner mindre end ~ 250 nm. For nylig er denne begrænsning blevet overvundet med indførelsen af super-opløsning fluorescensmikroskopi teknikker, såsom fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM). I modsætning til sine konventionelle kolleger, kan PALM producere billeder med en lateral opløsning af snesevis af nanometer. Det er således nu muligt at bruge fluorescens, med sine utallige styrker, at belyse et spektrum af tidligere utilgængelige attributter af cellestruktur og organisation.
_content "> Desværre PALM er ikke trivielt at implementere, og vellykkede strategier ofte skal være skræddersyet til den type system, der undersøges. I denne artikel viser vi, hvordan man gennemfører ensfarvede PALM studier af vesikulære strukturer i faste, dyrkede neuroner. PALM er velegnet til studiet af vesikler, der har dimensioner, der typisk spænder fra ~ 50-250 nm. Vigtige skridt i vores tilgang omfatter mærkning neuroner med photoconvertible (grøn til rød) kimærer af vesikel last, indsamling af spredte, indsamlede rå billeder med et super-opløsning mikroskopi system og behandling af RAW-billeder til at producere en høj opløsning PALM image. Vi viser også effekten af vores tilgang ved at præsentere usædvanligt godt løst billeder af tæt-core vesikler (DCVs) i dyrkede hippocampusneuroner, der tilbagevise den hypotese, at ekstrasynaptiske handel med DCVs medieres hovedsageligt ved DCV klynger.Introduction
En række cellulære processer er afhængige af præcis og effektiv vesikel-medieret handel af biomolekyler til specifikke subcellulære destinationer. Et prominent eksempel er synaptisk forsamling, der forud for lang varierede, vesikel-medieret levering af synaptiske bestanddele fra steder biogenese i den neuronale soma til potentielt distale præ-og postsynaptiske steder 1.
Fluorescens mikroskopi er en kraftfuld og populær metode til at studere vesikeludveksling. Styrker af teknikken omfatter dens sensitivitet, specificitet og kompatibilitet med levende billeddannelse 2. Desværre indtil for relativt nylig er teknikken udsat for en væsentlig svaghed, diffraktionsbegrænset opløsning 2, hvilket hæmmer undersøgelser af strukturer med dimensioner mindre end ~ 250 nm. For nylig, lateral opløsning i fluorescens mikroskopi overgået diffraktion barriere med indførelsen af super-opløsning fluorescens microscopy teknikker, såsom PALM 3. Den laterale opløsning på PALM, snesevis af nanometer, er velegnet til studiet af vesikler, der har dimensioner, der typisk spænder fra ~ 50-250 nm 4.. Det er således nu muligt at bruge fluorescens, med sine utallige styrker, til at belyse et spektrum af tidligere utilgængelige attributter af vesikler, herunder visse aspekter af deres handel til specifikke subcellulære sites.
PALM er ikke trivielt at implementere, og vellykkede strategier ofte skal være skræddersyet til den type system, der undersøges. Her beskriver vi, hvordan man gennemfører PALM studier af vesikuløse strukturer, og vi påvise effekten af vores tilgang til tilfælde af DCVs i hippocampus neuroner. Især bruger vi PALM til at løse den hypotese, at handel med DCVs til synapser i hippocampus neuroner medieres af DCV klynger 5-8.
Cluster-medieret handel med vesikler til synapser i udviklingslandene neurons er en spændende mulighed, fordi det kan lette en hurtig synaptic stabilisering og montage 9,10. Fortalere for klynger handel med DCVs citere stort tilsyneladende størrelse på ekstrasynaptiske fluorescerende puncta huser eksogene DCV last som dokumentation for clustering 6. Men disse puncta vises i billeder genereret ved hjælp af diffraktion-begrænset fluorescens mikroskopi teknikker, der ikke egner sig til størrelseseffekter skelne skyldes diffraktion fra dem, der opstår fra klyngedannelse.
For at løse dette problem, vi indsamlede konventionel Widefield fluorescens og PALM billeder af hippocampus neuroner udtrykker kimærer målrettet til DCVs. Analyse af disse billeder viste, at> 92% af formodede ekstrasynaptiske DCV klynger i konventionelle billeder er løst som 80 nm (individuel DCV-størrelse) 11 puncta i Palm billeder. Således er disse data i høj grad afkræfte clustering hypotese, som anvendes til DCVs i udviklingen hippocampal neuroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM og relaterede super opløsning fluorescens mikroskopi teknikker har for nylig dukket op som et værdifuldt supplement til bedre etablerede former for optisk mikroskopi og elektronmikroskopi (EM) 22-24. Positive egenskaber for PALM omfatter relativt simple prøveforberedelse og minimal prøve forstyrrelse. I princippet også PALM kan bruges til at studere levende celler. Sandsynligvis den vigtigste negative egenskab af PALM er tidskrævende dataindsamling, som i væsentlig grad hæmmer undersøgelser af h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud 2 R15 GM061539-02 (til BAS), 2 R15 NS40425-03 (til JEL), MH 66.179 (Dr. Gary Banker of Oregon Health & Science University / OHSU), og P30 NS061800 (Dr. Sue Aicher af OHSU). Vi takker Barbara Smoody for omfattende støtte med den kultur af hippocampus neuroner, og Drs. Brian Lang og James Abney for en kritisk læsning af dette manuskript.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
